Método simples para DNA de Fluorescência<em> In Situ</em> A hibridação com Cromossomos Squashed
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Esta abordagem é particularmente eficaz em mapeamento de sequências altamente repetitivas para regiões heterocromáticas, onde abordagens computacionais enfrentam desafios proibitivos. Aqui nós descrevemos um protocolo simplificado para DNA ISH que contorna lavagens formamida que são etapas padrão em outros protocolos de DNA ISH. Nosso protocolo é otimizado para a hibridação com sondas de DNA vertente individuais curtas que levam corantes fluorescentes, o que efetivamente marcam sequências de DNA repetitivas dentro de regiões cromossômicas heterocromáticos através de um número de diferentes tipos de tecidos do inseto. No entanto, os pedidos podem ser estendido para usar com sondas maiores e visualização de sequências de DNA única cópia (não repetitivo). Demonstramos esse método mapeando várias sequências repetitivas diferentes de cromossomos esmagados de Drosophila melanogaster células neurais e Nasoniavitripennis espermatócitos. Mostramos padrões de hibridização, quer para pequenas sondas, sintetizados comercialmente e para uma sonda maior para comparação. Este procedimento utiliza material de laboratório simples e reagentes, e é ideal para os investigadores que têm pouca experiência com a realização de DNA ISH.
Introduction
ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Sondas para regiões de cópia única dentro euchromatin pode ser gerado através de um punhado de abordagens, incluindo nick-tradução ou de fim-de rotulagem dos produtos de ADN longas 1,2 ea incorporação de deoxygenin (DIG) nucleotídeos -attached e seu reconhecimento através de uma ampla variedade de anticorpos conjugados do grupo 1-3. Visualização das sequências eucromáticos em poucos ou número único de cópia requer a utilização quer de sondas individuais grandes, com uma actividade específica elevada ou um cocktail de sondas múltiplas mais pequenas, que aumentam colectivamente sinal.
Em contraste, as sequências altamente repetitivas encontradas na heterocromatina, tais como DNAs satélite, são alvos mais fáceis para DNA ISH porque normalmente existe como dezenas de milhares de repetições agrupados em regiões cromossômicas únicos conhecidos como blocos. Elementos de transposição também pode serencontrado em altos números de cópia na distinta loci cromossômica 2. Nestes casos, as sondas individuais com baixa actividade específica pode rotular eficazmente sequências de heterocromatina, devido à sua hibridação em múltiplos locais. Sondas para seqüências repetitivas podem ser sintetizados oligonucleotídeos comercialmente como curtos (30-50 pb) e quimicamente conjugado com qualquer um dos vários grupos fluorescentes diferentes. Mapeando seqüências repetitivas dentro heterochromatin por meio de tecnologias de sequenciamento do genoma-se difícil devido aos desafios enfrentados em andaimes de construção dentro de blocos de satélite altamente repetitivas 4-6,7. Atualmente, ISH se destaca como a forma mais eficaz de mapear essas seqüências ao nível sub-cromossomo. Essa estratégia é importante para o mapeamento de um grande número de sequências repetitivas que estão sendo descobertos por estudos de genoma e transcriptoma de sequenciamento em curso.
A eficiência e facilidade de mapeamento de seqüências repetitivas nos cromossomos-montado slides seria greatly reforçada por um protocolo simplificado de DNA ISH. Por exemplo, os protocolos existentes para ADN ISH envolver múltiplas lavagens de tecidos hibridados em solução de formamida a 2,8, adicionando assim substancialmente para o tempo requerido para as sequências de mapeamento e também a produção de grandes quantidades de resíduos químicos para este reagente dispendioso. Aqui nós descrevemos um método DNA ISH revista que contorna a necessidade de lavagens formamida e utiliza equipamentos básicos de laboratório e reagentes. Este método foi originalmente projetado para o rápido mapeamento de seqüências de DNA altamente repetitivos em regiões heterocromáticas de neuroblastos de larvas de Drosophila usando oligos sintetizados no mercado que são conjugados com corantes fluorescentes. No entanto, este método também funciona para o mapeamento de seqüências repetitivas usando sondas maiores sintetizados através de outros meios 9,10 e em vários tipos de tecidos e de cromossomos diferentes. Além disso, este método pode ser utilizado para mapear sequências eucromáticos utilizando mais ou multiple, sondas curtas dentro da sequência euchromatic de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA ISH é freqüentemente usado para mapear sequências específicas para os cromossomas. Nós descrevemos um método simples para o ADN ISH optimizado para elevado número de cópias, sequências de heterocromatina. Em vez de utilizar lavagens numa solução de formamida, que é um requisito em outros protocolos ISH ADN existentes, colocamos lâminas montadas-tecido directamente sobre um bloco de pré-aquecida para desnaturar o ADN. Este método evita o uso de grandes quantidades de formamida. Um passo fundamental par…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
References
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