परिधीय रक्त Hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रेरण
Summary
एक विधि सीधे परिधीय रक्त कोशिकाओं से समृद्ध hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था।
Abstract
मानव रोग विशिष्ट neuronal संस्कृतियों मानव मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए इन विट्रो मॉडल में पैदा करने के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, प्राथमिक मानव वयस्क तंत्रिका संस्कृतियों के लिए उपयोग की कमी अद्वितीय चुनौतियों को जन्म देती है। प्रेरित स्टेम सेल में हाल के घटनाक्रम (IPSC) रोगी विशिष्ट IPSC के माध्यम से त्वचा fibroblasts से तंत्रिका संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है, लेकिन इस प्रक्रिया श्रम गहन है, विशेष विशेषज्ञता और संसाधनों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है, और कई महीने लग सकते हैं। यह मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन के लिए इस तकनीक का व्यापक आवेदन को रोकता है। इनमें से कुछ मुद्दों पर काबू पाने के लिए, हम IPSC व्युत्पत्ति प्रक्रिया को दरकिनार सीधे मानव वयस्क परिधीय रक्त से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक विधि विकसित किया है। मानव वयस्क परिधीय रक्त से समृद्ध hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं इन विट्रो में सुसंस्कृत थे और, अक्टूबर ट्रांसक्रिप्शनल कारकों Sox2 युक्त सेंडाइ वायरस वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट3/4, Klf4, और सी-Myc। आगे बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) और संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) युक्त मानव तंत्रिका पूर्वज माध्यम का उपयोग कर से चुना जाता है, जो कोशिकाओं में morphological परिवर्तन में अभिकर्मक का परिणाम है। जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं ऐसे nestin और Sox2 के रूप में तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर, के लिए अभिव्यक्ति की विशेषता है। इन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को आगे न्यूरॉन्स, अस्थिकणिका और निर्दिष्ट भेदभाव मीडिया में oligodendrocytes के लिए भेदभाव किया जा सकता है। आसानी से सुलभ मानव परिधीय रक्त के नमूनों का उपयोग करना, इस विधि मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के इन विट्रो मॉडलिंग के लिए तंत्रिका कोशिकाओं को आगे भेदभाव के लिए तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और उन बीमारियों के रोगजनन और उपचार से संबंधित पढ़ाई अग्रिम कर सकते हैं।
Introduction
इन विट्रो में neuronal संस्कृतियों मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन के लिए एक बुनियादी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। प्राथमिक पशु (ज्यादातर कृंतक) तंत्रिका संस्कृतियों 1, 2 और gliomas या अन्य ट्यूमर से निकाली गई मानव तंत्रिका कोशिका लाइनों सबसे अधिक इस्तेमाल इस तरह के अध्ययन में हैं। हालांकि, यह कृंतक और मानव कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण मतभेद हैं कि मान्यता दी गई है। कृन्तकों के आधार पर कई निष्कर्षों मनुष्य के लिए अनुवाद नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, जन जीनोमिक जानकारी और अपेक्षाकृत आसान जीन संपादन और पूरे जीनोम अनुक्रमण का विश्लेषण करने में तेजी से विकास के साथ, इस रुझान को अधिक से अधिक गियर कुछ मानव न्यूरोनल बनाता है, जो रोग होने का खतरा जीन की खोज और विशिष्ट रोगों में उनके कार्यों और भूमिकाओं का वर्णन करने के लिए है सेल लाइनों केवल उपयोग सीमित है। सैद्धांतिक रूप से, रोगी तंत्रिका तंत्र के नमूनों से व्युत्पन्न मानव प्राथमिक तंत्रिका संस्कृतियों का सबसे अच्छा विकल्प हैं, लेकिन वे प्राप्त करने के लिए असंभव है; इसलिए वैकल्पिक मेथODS जरूरी हैं। हाल के वर्षों में, कुछ दृष्टिकोण दो सबसे अलग पहचाना जा रहा है, के साथ चलाया जा रहा है। पैदा करने के लिए प्रेरित किया स्टेम कोशिकाओं (IPSC) का उपयोग माउस और मानव दैहिक कोशिकाओं की तकनीक के विकास के बाद 3, 4, तंत्रिका कोशिकाओं उन्हें 5-7 से आगे भेदभाव किया जा सकता है। हालांकि, सृजन और IPSC निस्र्पक गहन श्रम, तकनीक, और समय इनपुट की मांग है, कभी कभी भी बेहद। कुछ ही समय बाद, एक और दृष्टिकोण सीधे दैहिक कोशिकाओं 8, 9 से neuronal कोशिकाओं को बदलने के लिए विकसित किया गया था। जिसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स गैर प्रफलन हो रहे हैं, यह गहन अध्ययन और कोशिकाओं की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है जो दवा स्क्रीनिंग, में अपने आवेदन की सीमा। दोनों तकनीकों, तंत्रिका स्टेम के प्रत्यक्ष व्युत्पत्ति का लाभ लेने के / दैहिक कोशिकाओं से पूर्वज कोशिकाओं को अभी भी IPSC पीढ़ी और लक्षण लेकिन प्रावधानों की थकाऊ प्रक्रिया को नजरअंदाज जो कई समूहों 10-12, द्वारा पता लगाया गया हैदेस बाद में तंत्रिका भेदभाव के लिए तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के एक सभ्य संख्या। हम पहले हिमेटोपोयटिक पूर्वज कोशिकाओं में यामानाका प्रतिलेखन कारक की शुरूआत के बाद, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को सीधे मध्यम 13 का चयन एक तंत्रिका पूर्वज सेल का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है कि पता चला है। यहाँ, हम विस्तार से विधि की रिपोर्ट।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीधे परिधीय hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है।
Fibroblast कोशिकाओं की तुलना में, मानव परिधीय रक्त अधिक सुलभ है।…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Materials
| Material List | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Separation Medium | Lonza | 17-829E | 1 X |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 mL |
| Human Serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2mM |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1X |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1X |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/mL |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/mL |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/mL |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/mL |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/mL |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1X |
| N2 supplement | Life technologies | 17502-048 | 1X |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life technologies | 17504-044 | 1X |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1X |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | 1X |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1X |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 ug/ml |
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