말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도
Summary
직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.
Abstract
인간의 질병 특정의 연결을 문화는 인간의 신경 질환에 대한 체외 모델의 생성에 필수적이다. 그러나, 인간 성인 일차 배양 신경에 대한 액세스는 고유의 부족 문제를 제기한다. 유도 만능 줄기 세포의 최근 개발 (IPSC)는 환자의 특정 IPSC을 통해 피부 섬유 아 세포에서 신경 문화를 유도하기 위해 또 다른 방법을 제공하지만,이 과정은 노동 집약적이며, 특별한 전문 지식과 자원의 많은 양을 필요로하고, 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 이것은 신경 질환의 연구에이 기술의 다양한 응용 프로그램을 방지 할 수 있습니다. 이러한 문제들을 극복하기 위해, 우리는 IPSC 도출 과정을 거치지 않고, 직접 사람 성인 말초 혈액으로부터 신경 줄기 세포를 유도하는 방법을 개발 하였다. 성인 인간의 말초 혈액에서 농축 조혈 전구 세포가 시험 관내에서 배양하고 10 월을 전사 요인 SOX2 함유 센다이 바이러스 벡터로 형질3/4, Klf4 및 c-Myc와. 상기 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 인간 신경 전구 매체를 이용하여 선택되는 세포의 형태 학적 변화의 형질 전환 결과. 생성 된 세포는 네 스틴과 같은 SOX2 같은 신경 줄기 세포 마커에 대한 발현을 특징으로한다. 이러한 신경 줄기 세포는 더 뉴런, 아스트로 글 리아 세포가 지정된 차별화 미디어에서 희소 돌기 아교 세포로 분화 될 수있다. 쉽게 접근 인간 말초 혈액 샘플을 사용하여,이 방법은 신경 질환의 체외 모델링 신경 세포로 더욱 분화 신경 줄기 세포를 유도하는데 이용 될 수 있으며, 이들 질환의 병인 및 치료에 관한 시험을 진행할 수있다.
Introduction
시험관 내에서의 연결을 문화는 신경 질환의 연구를위한 기본적인 도구로 사용되어왔다. 일차 동물 (주로 쥐) 신경 배양 1, 2, 또는 다른 신경 교종 종양에서 유래 인간 신경 세포주는 가장 일반적으로 사용되는 등의 연구에있다. 그러나, 설치류 및 인간 세포 사이에 상당한 차이가 있음을 인식하고있다. 설치류에 기초하여 다수의 발견은 인간으로 변환 될 수 없다. 또한, 대량의 게놈 정보 및 비교적 쉽게 유전자 편집 및 총 유전체 분석의 급속한 발전과 함께, 추세는 더욱 기어 몇몇 인간 신경 세포를 만드는 질병 경향 유전자를 검색하고 특정 질환의 기능 및 역할을 서술하는 것 세포주 만 사용을 제한. 이론적으로, 환자 신경계의 샘플에서 파생 된 인간의 기본 신경 문화 최선의 선택을하지만 그들은 얻을 불가능하다; 따라서 다른 메타ODS가 필요합니다. 최근 몇 년 동안, 몇몇 접근법은 두 가장 구별되는 함께 진행되고있다. 생성 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC)을 사용하여 마우스 및 인간 체세포 기술의 발달에 따라 3, 4는, 신경 세포들을 상기 5-7에서 차이가있을 수있다. 그러나, 생성 및 IPSC을 특성화하는 것은 노동 집약적, 기술, 시간 입력을 요구하고, 때로는 엄청나게. 얼마 후, 또 다른 접근 방식은 직접 체세포 8, 9에서 신경 세포를 변환하기 위해 개발되었다. 생성 된 뉴런 비 증식하는, 그 예의 연구 및 세포 많이 필요 약물 스크리닝에의 응용을 제한한다. 두 가지 기술, 신경 줄기를 직접 유도의 장점을 활용하려면 / 체세포에서 전구 세포는 여전히 IPSC 생성 및 특성화하지만 있습니다 provi의 지루한 과정을 거치지 여러 그룹 10-12에 의해 탐구되었다데 나중에 신경 분화 신경 줄기 세포의 괜찮은 번호. 우리는 이전에 조혈 전구 세포로 야마나카 전사 인자의 도입 다음, 신경 줄기 세포가 직접적으로 매체 (13)를 선택하는 신경 전구 세포를 이용하여 생성 될 수 있음을 보여 주었다. 여기서 우리는 자세히 방법을보고한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
직접 주연 조혈 전구 세포로부터 신경 줄기 세포를 생성하는 상세한 프로토콜이 제공된다.
섬유 아세포에 비교하여, 인간 말초 혈액 더 접근 할 수있다. 제시된 프로토콜 이상 1 × 105 조혈 전구 세포 또는 CD34 양성 세포를 이용하여, 전혈을 10 ㎖에서 농축 될 수있다. 혈소판 오염 보통 예방하지 않지만, 용이하게, 저속 원심 분리에 의해 감소 될 수 있으며 신경 줄?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Materials
| Material List | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Separation Medium | Lonza | 17-829E | 1 X |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 mL |
| Human Serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2mM |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1X |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1X |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/mL |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/mL |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/mL |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/mL |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/mL |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1X |
| N2 supplement | Life technologies | 17502-048 | 1X |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life technologies | 17504-044 | 1X |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1X |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | 1X |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1X |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 ug/ml |
References
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