Direkte Induction of Human Neural stamceller fra perifert blod Hematopoietiske stamceller

Summary

En metode ble utviklet for å direkte utlede humane nevrale stamceller fra hematopoetiske progenitorceller anriket fra perifere blodceller.

Abstract

Menneskelig sykdom spesifikke nevronale kulturer er avgjørende for å generere in vitro modeller for menneskelige nevrologiske sykdommer. Reiser imidlertid mangel på tilgang til primære menneskelige voksen nevrale kulturer unike utfordringer. Den siste utviklingen i induserte pluripotente stamceller (IPSC) gir en alternativ tilnærming til å utlede nevrale kulturer fra hudfibroblaster gjennom pasientspesifikk IPSC, men denne prosessen er arbeidskrevende, krever spesiell kompetanse og store mengder ressurser, og kan ta flere måneder. Dette forhindrer den brede anvendelsen av denne teknologien til studiet av nevrologiske sykdommer. Å overvinne noen av disse problemene, har vi utviklet en metode for å utlede nevrale stamceller direkte fra voksent menneske perifert blod, utenom IPSC avledning prosessen. Hematopoetiske progenitorceller anriket fra et voksent menneske perifert blod ble dyrket in vitro og transfektert med Sendai-virus-vektorer inneholdende transkripsjonsfaktorer Sox2, oktober3/4, Klf4, og c-Myc. Transfeksjon resulterer i morfologiske forandringer i cellene som er videre valgt ved hjelp av human neurale stamcellemedium inneholdende basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). De resulterende celler som er kjennetegnet ved ekspresjon for neural stamcelle markører, slik som nestin og SOX2. Disse nevrale stamceller kan bli ytterligere differensiert til nevroner, astroglia og oligodendrocytter i spesifisert differensiering media. Ved hjelp av lett tilgjengelige humane perifere blodprøver, kan denne fremgangsmåte benyttes til å utlede neurale stamceller for ytterligere differensiering til nerveceller in vitro for modellering av nevrologiske sykdommer og kan videre studier relatert til patogenesen og behandling av disse sykdommer.

Introduction

In vitro neuronale kulturer har blitt brukt som et viktig verktøy for studier av nevrologiske sykdommer. Primær dyr (for det meste gnager) nevrale kulturer ^{1, 2} og menneske nevrale cellelinjer som stammer fra hjernesvulst eller andre svulster er den mest brukte i slike studier. Imidlertid har det blitt erkjent at det er betydelige forskjeller mellom gnagere og humane celler. Mange funn basert på gnagere kan ikke oversettes til mennesker. Videre, med den raske utviklingen innen analysere masse genomisk informasjon og relativt enkelt gen redigering og hele genomsekvensering, er mer og mer rettet til å oppdage sykdomsutsatte gener og opptegning sine funksjoner og roller i spesifikke sykdommer, noe som gjør de få menneske nevronale trenden cellelinjer har bare begrenset bruk. Teoretisk humane primære nevrale kulturer som stammer fra prøver av pasienten nervesystemet er det beste valget, men de er umulig å oppnå; dermed alternativ methODS er nødvendig. De siste årene har enkelte tilnærminger blitt forfulgt, med to blir det mest synlig. Etter utviklingen av teknikken med å generere induserte pluripotente stamceller (IPSC) ved hjelp av mus og humane somatiske celler ^{3, 4,} kan nevrale celler bli ytterligere differensiert fra dem ^5-7. Men å generere og karakter IPSC krever intensiv arbeidskraft, teknikker og tid innspill, noen ganger også uoverkommelig. Kort tid etter ble en annen tilnærming utviklet til direkte forvandle nevronale celler fra somatiske celler ^{8, 9.} Som de resulterende neuroner er ikke-proliferativ, begrenser det dens anvendelse i intensive studier og medikamentscreening, noe som krever en stor mengde celler. For å ta fordelene av både teknikker, direkte avledning av nevrale stilk / stamceller fra somatiske celler har blitt utforsket av flere grupper ^10-12, som omgår den kjedelige prosessen med IPSC generasjon og karakterisering men fortsatt provides et anstendig antall nevrale stamceller for senere nevrale differensiering. Vi har tidligere vist at etter innføring av Yamanaka transkripsjonsfaktorer i hematopoetiske progenitorceller, neurale stamceller kan bli direkte dannet ved anvendelse av en neural stamceller velge medium ^13. Her rapporterer vi metoden i detalj.

Protocol

1. berikelse av blodkreft stamceller fra voksne Whole Blood NOTE: Hematopoetiske progenitorceller eller CD34 + celler kan bli renset fra perifere mononukleære blodceller (PBMC) avledet fra en rekke kilder inkludert ledningen blod, leukaferese materiale og helt blod ved hjelp av densitetgradientsentrifugering baserte metoder. Metoden oppført her bruker fullblod som et eksempel. Isolering av PBMC fra Whole Blood: Legg 4,5 ml lymfocytt separasjonsmedium til SepMate røret …

Representative Results

Kvaliteten på CD34-celler er avgjørende for suksess for neural stamcelle transduksjon. Høy kvalitet CD34 celler sprer løpet av de første par dagene av kultur og vises som ikke tilhenger, homogent runde celler, flyter like over bunnen av kulturskip (figur 1A). De vellykkede infeksjon resulterer i celle aggregater, som vokser over tid (figur 1B), mens ikke-spesifikke celleaggregater kan oppstå under cellekultur, som utvider og foreninger er løs. Heftende celler vises vanligvi…

Discussion

En detaljert protokoll for direkte å produsere neurale stamceller fra perifert hematopoetiske stamceller er gitt.

Sammenlignet med fibroblastceller, er humant perifert blod mer tilgjengelige. Ved hjelp av den fremlagte protokoll, mer enn 1 x 10 ⁵ hematopoietiske stamceller, eller CD34-positive celler, kan anrikes fra 10 ml fullblod. Selv om forurensning med blodplater er vanligvis ikke forebygges, kan det være lett reduseres ved lavere hastighet sentrifugering, og det ikke forst…

Materials

Material List
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lymphocyte Separation Medium	Lonza	17-829E	1 X
SepMate	Stemcell Technologies	15415	15 mL
Human Serum	Invitrogen	34005-100
Antibiotics	Gibco	15240-062	1%
CD34 MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-056-701
EDTA	Cellgro	46-034-Cl	2mM
MACS LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
StemSpan SFEM Medium	Stemcell Technologies	9650	1X
IMDM	Quality Biologicals	112-035-101	1X
TPO	Peprotech	300-18	100 ng/mL
Flt-3	Peprotech	300-19	100 ng/mL
SCF	Peprotech	300-07	100 ng/mL
IL-6	Peprotech	200-06	20 ng/mL
IL-7	Peprotech	200-07	20 ng/mL
IPS Sendai Reprogramming Kit	Life technologies	A1378001
Cell scraper	Sarstedt	83.183
DMSO	Sigma	D2650
CryoTube vials	Thermo	368632
Mr. Frosty container	Thermo	5100-0001
DMEM/F12	Life technologies	12400-024	1X
N2 supplement	Life technologies	17502-048	1X
Bovine serum albumin	Sigma	A2934	0.1% (w/v)
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 supplement	Life technologies	17504-044	1X
NSC serum free medium	Life Technologies	A1050901	1X
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips	BD Bioscences	354087
cAMP	Sigma	A9501	300 ng/ml
Vitamin C	Sigma	A0278	0.2 mM
BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml
GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/ml
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957	1X
PDGF-AA	Peprotech	100-13A	10 ng/ml
NT-3	Peprotech	450-03	2 ng/ml
Shh	Peprotech	1314-SH/CF	2 ng/ml
T3	Sigma	T6397	3 nM
PFA	Sigma	P6148	4%
PBS	Quality Biological	119-069-101	1X
Goat serum	Sigma	G9023	4%
TritonX-100	Sigma	T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin	Millipore	AB5922	1:1000 dilution
Anti-SOX2  antibody	Applied Stemcell	ASA0120	Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody	Promega	G712A	1:1000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody	Sigma	G4546	1:100 dilution
Anti-O4 antibody	R&D Systems	MAB1326	IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody	Life techniologies	A11012	1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody	Life techniologies	A11001	1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody	Life techniologies	A21042	1:250 dilution
DAPI	Sigma	D9542	1 ug/ml