Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Summary

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Abstract

Culturas neuronais específicos doenças humanas são essenciais para a geração de modelos in vitro para doenças neurológicas humanos. No entanto, a falta de acesso para culturas neuronais adultas humanas primárias coloca desafios. Desenvolvimentos recentes em células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) fornece uma abordagem alternativa para derivar culturas neurais a partir de fibroblastos da pele através de paciente iPSC específico, mas este processo é trabalhoso, exige conhecimentos especiais e grandes quantidades de recursos, e pode levar vários meses. Isso impede que a ampla aplicação desta tecnologia para o estudo de doenças neurológicas. Para superar algumas destas questões, temos desenvolvido um método para obter células-tronco neurais diretamente do sangue periférico humano adulto, ignorando o processo de derivação da IPSC. As células progenitoras hematopoiéticas enriquecidos a partir do sangue periférico humano adulto foram cultivadas in vitro e transfectadas com vectores de vírus Sendai contendo factores de transcrição Sox2, Out3/4, KLF4, e c-Myc. Os resultados de transfecção em alterações morfológicas nas células, que são ainda seleccionadas usando meio progenitora neuronal humana contendo factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). As células resultantes são caracterizadas pela expressão de marcadores de células estaminais neuronais, tal como a nestina e SOX2. Essas células-tronco neurais pode ser ainda mais diferenciado para os neurônios, astroglia e oligodendrócitos em media diferenciação especificado. Utilizando amostras de sangue periférico humano facilmente acessíveis, este método pode ser utilizado para derivar células estaminais neurais para uma maior diferenciação para células neuronais in vitro de modelagem de desordens neurológicas e pode avançar estudos relacionados com a patogénese e tratamento dessas doenças.

Introduction

In vitro, as culturas neuronais têm sido utilizados como uma ferramenta fundamental para o estudo de doenças neurológicas. Animais primária (principalmente roedor) culturas neurais ^{1, 2} e linhas celulares neurais humanas derivadas de tumores ou outros gliomas são os mais vulgarmente utilizados em tais estudos. No entanto, tem sido reconhecido que existem diferenças significativas entre os roedores e células humanas. Muitos resultados baseados em roedores não pode ser traduzido para os seres humanos. Além disso, com a rápida evolução da análise de informação de massa genômica ea edição gene relativamente fácil e seqüenciamento do genoma inteiro, a tendência é cada vez mais orientada para a descoberta de genes de doenças propensas e delinear suas funções e papéis em doenças específicas, o que torna os poucos neuronal humana linhas celulares só têm limitado o uso. Teoricamente, as culturas neuronais primárias humanas derivadas a partir de amostras do sistema nervoso do paciente são a melhor escolha, mas eles são impossíveis de se obter; meth, portanto, alternativaods são necessárias. Nos últimos anos, algumas abordagens têm sido perseguidos, com dois sendo o mais distinguíveis. Seguindo o desenvolvimento da técnica de geração de células pluripotentes estaminais induzidas (IPSC) usando o rato e células somáticas humanas ^{3, 4,} células neurais pode ser diferenciado a partir deles ^5-7. No entanto, a geração e caracterização iPSC exige mão de obra intensiva, técnicas e tempo de entrada, às vezes até exageradamente. Pouco depois, foi desenvolvido outro método para transformar directamente as células neuronais a partir de células somáticas ^{8, 9.} Como os neurónios resultantes são não-proliferativa, que limita a sua aplicação em estudos intensivos e rastreio de drogas, que requer uma grande quantidade de células. Para tirar vantagens de ambas as técnicas, derivação direta do tronco neurais / células progenitoras de células somáticas foi explorado por vários grupos de ^10-12, que ignora o tedioso processo de geração iPSC e caracterização, mas ainda provides um número razoável de células-tronco neurais para diferenciação neural mais tarde. Mostrámos previamente que, após a introdução dos factores de transcrição Yamanaka em células progenitoras hematopoiéticas, células estaminais neurais podem ser gerados directamente utilizando uma célula progenitora neuronal seleccionando meio ^13. Aqui, nós relatamos o método em detalhes.

Protocol

1. O enriquecimento de células progenitoras hematopoiéticas a partir de Sangue Total Adulto NOTA: progenitoras hematopoéticas ou células CD34 + podem ser purificados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) derivadas a partir de uma variedade de fontes, incluindo o sangue do cordão umbilical, material de leucoferese e sangue total usando métodos baseados em gradiente de densidade de centrifugação. O método está aqui usa sangue total como um exemplo. <l…

Representative Results

A qualidade das células CD34 é crítica para o sucesso da transdução de células estaminais neurais. As células CD34 alta qualidade proliferam durante o primeiro par de dias de cultura e aparecem como não aderentes, as células homogeneamente redondas, flutuando pouco acima do fundo de recipientes de cultura (Figura 1A). Os resultados de sucesso de infecção em agregados de células, que se expande ao longo do tempo (Figura 1B), enquanto os agregados de células não espec?…

Discussion

Um protocolo detalhado para gerar directamente células estaminais neurais a partir de células progenitoras hematopoiéticas periféricas é fornecido.

Em comparação com células de fibroblasto, de sangue periférico humano é mais acessível. Usando o protocolo apresentado, mais do que 1 x 10 ⁵ células progenitoras hematopoiéticas ou células positivas CD34, podem ser enriquecidos a partir de 10 ml de sangue total. Embora a contaminação com plaquetas normalmente não é pr…

Materials

Material List
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lymphocyte Separation Medium	Lonza	17-829E	1 X
SepMate	Stemcell Technologies	15415	15 mL
Human Serum	Invitrogen	34005-100
Antibiotics	Gibco	15240-062	1%
CD34 MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-056-701
EDTA	Cellgro	46-034-Cl	2mM
MACS LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
StemSpan SFEM Medium	Stemcell Technologies	9650	1X
IMDM	Quality Biologicals	112-035-101	1X
TPO	Peprotech	300-18	100 ng/mL
Flt-3	Peprotech	300-19	100 ng/mL
SCF	Peprotech	300-07	100 ng/mL
IL-6	Peprotech	200-06	20 ng/mL
IL-7	Peprotech	200-07	20 ng/mL
IPS Sendai Reprogramming Kit	Life technologies	A1378001
Cell scraper	Sarstedt	83.183
DMSO	Sigma	D2650
CryoTube vials	Thermo	368632
Mr. Frosty container	Thermo	5100-0001
DMEM/F12	Life technologies	12400-024	1X
N2 supplement	Life technologies	17502-048	1X
Bovine serum albumin	Sigma	A2934	0.1% (w/v)
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 supplement	Life technologies	17504-044	1X
NSC serum free medium	Life Technologies	A1050901	1X
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips	BD Bioscences	354087
cAMP	Sigma	A9501	300 ng/ml
Vitamin C	Sigma	A0278	0.2 mM
BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml
GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/ml
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957	1X
PDGF-AA	Peprotech	100-13A	10 ng/ml
NT-3	Peprotech	450-03	2 ng/ml
Shh	Peprotech	1314-SH/CF	2 ng/ml
T3	Sigma	T6397	3 nM
PFA	Sigma	P6148	4%
PBS	Quality Biological	119-069-101	1X
Goat serum	Sigma	G9023	4%
TritonX-100	Sigma	T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin	Millipore	AB5922	1:1000 dilution
Anti-SOX2  antibody	Applied Stemcell	ASA0120	Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody	Promega	G712A	1:1000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody	Sigma	G4546	1:100 dilution
Anti-O4 antibody	R&D Systems	MAB1326	IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody	Life techniologies	A11012	1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody	Life techniologies	A11001	1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody	Life techniologies	A21042	1:250 dilution
DAPI	Sigma	D9542	1 ug/ml