Direkt Induktion av humana neurala stamceller från perifert blod hematopoetiska progenitorceller
Summary
En metod har utvecklats för att direkt härleda mänskliga neurala stamceller från hematopoetiska progenitorceller anrikade från perifera blodceller.
Abstract
Humant sjukdomsspecifika neuronala kulturer är väsentliga för att generera in vitro-modeller för mänskliga neurologiska sjukdomar. Men bristen på tillgång till primära mänskliga vuxna neurala kulturer väcker unika utmaningar. Den senaste utvecklingen i inducerade pluripotenta stamceller (IPSC) ger en alternativ metod för att härleda neurala kulturer från hud fibroblaster genom patientens specifika iPSC, men denna process är arbetsintensiv, kräver särskild kompetens och stora resurser, och kan ta flera månader. Detta förhindrar den breda tillämpningen av denna teknik för studiet av neurologiska sjukdomar. För att övervinna några av dessa frågor har vi utvecklat en metod för att härleda neurala stamceller direkt från vuxen människa perifert blod, förbi härledningen processen iPSC. Hematopoetiska progenitorceller anrikade från vuxen människa perifert blod odlades in vitro och transfekterades med Sendai virusvektorer innehållande transkriptionfaktorer Sox2, Oct4/3, Klf4, och c-Myc. Transfektionen resulterar i morfologiska förändringar i cellerna som ytterligare selekteras genom användning av humana neurala progenitorceller medium innehållande basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). De resulterande cellerna kännetecknas av uttrycket för neurala stamcellsmarkörer, såsom nestin och Sox2. Dessa neurala stamceller skulle kunna ytterligare differentieras till neuroner, astroglia och oligodendrocyter i specificerade differentieringsmedia. Använda lättillgängliga humana perifera blodprover, kunde denna metod användas för att härleda neurala stamceller för ytterligare differentiering till neurala celler för in vitro modellering av neurologiska sjukdomar och kan avancera studier relaterade till patogenesen och behandling av dessa sjukdomar.
Introduction
In vitro neuronala kulturer har använts som ett grundläggande verktyg för studier av neurologiska sjukdomar. Primär djur (mestadels gnagare) neurala kulturer 1, 2 och mänskliga neurala cellinjer härledda från gliom eller andra tumörer är den vanligaste i sådana studier. Det har dock varit känt att det finns betydande skillnader mellan gnagare och mänskliga celler. Många fynd baserade på gnagare kan inte översättas till människor. Dessutom med den snabba utvecklingen inom analysera mass genetisk information och relativt lätt genen redigering och hela genomet sekvense är trenden mer och mer inriktad på att upptäcka sjukdomsbenägna gener och avgränsar deras funktioner och roller i specifika sjukdomar, vilket gör de få mänskliga neuronala cellinjer har endast begränsad användning. Teoretiskt humana primära neurala kulturer härledda från prover av patientens nervsystem är det bästa valet, men de är omöjligt att få; därmed alternativa methODS är nödvändiga. Under senare år har vissa metoder bedrivits, med två är det mest urskiljbara. Efter utvecklingen av tekniken med generera inducerade pluripotenta stamceller (IPSC) med musen och mänskliga somatiska celler 3, 4, kan neurala celler ytterligare differentierad från dem 5-7. Men generera och karaktärisera iPSC kräver intensiv arbetskraft, tekniker, och tidsinmatning, ibland till och med oöverkomligt. Strax efter, en annan metod utvecklats för att direkt omvandla neuronala celler från somatiska celler 8, 9. Eftersom de resulterande neuroner är icke-proliferativa, men det begränsar dess tillämpning i intensiva studier och läkemedelsscreening, vilket kräver en stor mängd celler. För att ta fördelarna av båda teknikerna, direkt härledning av neurala stam / progenitorceller från somatiska celler har undersökts av flera grupper 10-12, vilket kringgår tråkiga processen med iPSC generering och karakterisering men fortfarande bestämdes ett anständigt antal neurala stamceller för senare neurala differentiering. Vi har tidigare visat att efter införandet av de Yamanaka transkriptionsfaktorer in i hematopoetiska progenitorceller, neurala stamceller kan genereras direkt med hjälp av en neural progenitorcell välja mediet 13. Här rapporterar vi metoden i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
En detaljerad protokoll för att direkt generera neurala stamceller från perifera hematopoetiska progenitorceller tillhandahålls.
Jämfört med fibroblastceller, är mer tillgänglig humant perifert blod. Använda presenterade protokollet, mer än 1 x 10 5 hematopoietiska progenitorceller, eller CD34-positiva celler, kan anrikas från 10 ml helblod. Även förorening med trombocyter är oftast inte förebyggas, kan det vara lätt minskas med lägre hastighet centrifugering och d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Materials
| Material List | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Separation Medium | Lonza | 17-829E | 1 X |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 mL |
| Human Serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2mM |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1X |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1X |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/mL |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/mL |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/mL |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/mL |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/mL |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1X |
| N2 supplement | Life technologies | 17502-048 | 1X |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life technologies | 17504-044 | 1X |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1X |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | 1X |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1X |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 ug/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
