Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen
Summary
Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.
Abstract
Menschliche Krankheit spezifischen neuronalen Kulturen sind für die Erzeugung von in-vitro-Modellen für neurologische Erkrankungen des Menschen. Der fehlende Zugang zu primären humanen adulten neuralen Kulturen wirft jedoch einzigartige Herausforderungen. Die jüngsten Entwicklungen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) bietet einen alternativen Ansatz zur neuronalen Kulturen aus Hautfibroblasten durch patientenspezifische iPS ableiten, aber dieser Prozess ist arbeitsintensiv, erfordert spezielles Know-how und große Mengen an Ressourcen und kann mehrere Monate dauern. Dies verhindert, dass die breite Anwendung dieser Technologie auf die Untersuchung von neurologischen Erkrankungen. Um einige dieser Probleme zu überwinden, haben wir eine Methode, um neurale Stammzellen direkt aus menschlichen adulten peripheren Blut abgeleitet entwickelt, unter Umgehung der iPSC Ableitungsprozesses. Hämatopoetischen Vorläuferzellen aus humanen adulten peripheren Blut angereichert wurden in vitro kultiviert und mit Sendai-Virus-Vektoren, die Transkriptionsfaktoren Sox2, Oktober transfiziert3/4, Klf4 und c-Myc. Die Transfektionsergebnisse in morphologischen Veränderungen in den Zellen, die unter Verwendung von humanen neuralen Vorläufer Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) weiterhin ausgewählt sind. Die resultierenden Zellen werden durch die Expression neuronaler Stammzellenmarker wie Nestin und SOX2 gekennzeichnet. Diese Nervenstammzellen könnte weiter zu Neuronen, Astroglia und Oligodendrozyten in bestimmten Differenzierungsmedien unterschieden werden. Mit leicht zugänglichen menschlichen peripheren Blut-Proben, könnte diese Methode verwendet werden, um neurale Stammzellen zur weiteren Differenzierung zu Nervenzellen für In-vitro-Modellierung von neurologischen Störungen abgeleitet werden und können Studien zur Pathogenese und Behandlung dieser Krankheiten zu fördern.
Introduction
In vitro haben neuronalen Kulturen als ein grundlegendes Instrument für die Untersuchung von neurologischen Erkrankungen eingesetzt. Primäre tierische (meist Nagetier) neuronalen Kulturen 1, 2 und humanen neuralen Zelllinien aus Gliomen und anderen Tumore abgeleitet sind die am häufigsten verwendete in solchen Studien. Jedoch wurde erkannt, dass es signifikante Unterschiede zwischen Nager- und menschliche Zellen. Viele Erkenntnisse basierend auf Nagetiere können nicht auf den Menschen übertragen werden. Darüber hinaus mit der rasanten Entwicklung bei der Analyse von Massen genomischer Informationen und die relativ einfach Gen Bearbeitung und Sequenzierung ganzer Genome, geht der Trend immer mehr darauf ausgerichtet, die Entdeckung Krankheit anfällig Gene und die Abgrenzung ihrer Funktionen und Rollen in bestimmten Krankheiten, die die wenigen menschlichen neuronalen macht Zelllinien sind nur begrenzt Gebrauch. Theoretisch humanen primären neuronalen Kulturen aus Proben von Patienten Nervensystem abgeleitet werden, sind die beste Wahl, aber sie unmöglich zu erhalten sind; daher alternative meththoden notwendig. In den letzten Jahren haben einige Ansätze verfolgt, mit zwei die unterscheidbar. Nach der Entwicklung der Technik der Erzeugung von pluripotenten Stammzellen (iPS) unter Verwendung der Maus und menschliche Körperzellen 3, 4, Nervenzellen weiter differenziert daraus 5-7 sein könnte. Allerdings Erzeugung und Charakterisierung iPSC verlangt intensive Arbeit, Techniken und Zeitaufwand, manchmal sogar unerschwinglich. Kurze Zeit später wurde ein anderer Ansatz entwickelt, um direkt zu verwandeln neuronalen Zellen aus somatischen Zellen 8, 9. Die resultierenden Neuronen nichtproliferativer schränkt sie ihre Anwendung in intensive Studien und Wirkstoff-Screening, die eine große Menge an Zellen benötigt. Um die Vorteile beider Techniken, direkte Ableitung von neuralen Stammzellen nehmen / Vorläuferzellen aus Körperzellen wurde von mehreren Gruppen von 10 bis 12, das die mühsame Prozess der iPSC Herstellung und Charakterisierung, aber immer noch provi umgeht erforschtdes eine anständige Anzahl von neuralen Stammzellen für spätere neuronalen Differenzierung. Wir haben zuvor gezeigt, dass nach der Einführung der Yamanaka Transkriptionsfaktoren in hämatopoetische Vorläuferzellen, neurale Stammzellen können direkt mit einer neuralen Vorläuferzelle-Auswählschaltung Medium 13 erzeugt werden. Hier berichten wir über die Verfahren im Einzelnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein detailliertes Protokoll, um direkt zu generieren neuralen Stammzellen aus dem peripheren hämatopoetischen Vorläuferzellen ist.
Im Vergleich zu Fibroblasten, ist menschlichem peripheren Blut leichter zugänglich. Verwendung des vorgestellten Protokoll, mehr als 1 x 10 5 hämatopoetischen Vorläuferzellen oder CD34-positiven Zellen aus 10 ml Vollblut angereichert werden. Obwohl Kontamination mit Blutplättchen ist normalerweise nicht vermeidbar, kann es leicht durch Niederalky…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Materials
| Material List | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Separation Medium | Lonza | 17-829E | 1 X |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 mL |
| Human Serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2mM |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1X |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1X |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/mL |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/mL |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/mL |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/mL |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/mL |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1X |
| N2 supplement | Life technologies | 17502-048 | 1X |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life technologies | 17504-044 | 1X |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1X |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | 1X |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1X |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 ug/ml |
References
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