Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
Musen olfaktoriske epitel i næsehulen omfatter 6-10.000.000 bipolære olfaktoriske sensoriske neuroner 1. Hver olfaktoriske neuron vælger en af 1.200 odorantreceptor gener til ekspression. Påvisning af lugtstoffer starter med lugtstof binding til en olfaktorisk receptor 2, som derefter aktiverer adenylylcyclase type III (ACIII) 3 via olfaktoriske specifikke G-protein Ga olf 4. Den resulterende stigning i cAMP (cAMP) åbner en cyklisk nukleotid-gated (CNG), ikke-selektive kationkanal fører til tilstrømningen af Ca 2+ og Na +, derefter Ca 2+ tilstrømning fører til åbning af en Ca2 + aktiveret Cl – kanal 5,6. Den resulterende udad Cl – flux lettes af en høj intracellulær Cl – koncentration opretholdes ved steady Cl – optagelse, sandsynligvis via Na + / K + / Cl – cotransporter NKCC1 denCl – / HCO3 – varmeveksler SLC4A1, og måske yderligere endnu ikke identificerede transportører 6-8.
Bipolære olfaktoriske neuroner har enkelt, uforgrenede axoner, der strækker direkte til lugtekolben, og dendritceller, der strækker sig til overfladen af epitelet og slutter som en specialiseret rum, dendritiske knop. Fra denne knop, 10-30 cilier, som kan nå en længde på op til 50-60 um, hidrører i slim dækker epiteloverfladen 9. Proteiner af den kanoniske signaltransduktionskaskade hovedsagelig lokaliseret i membranen af disse cilier. Den øgede sensoriske overflade af epitelet forstærker evnen til at detektere lugtstoffer. På grund af tætheden af sensoriske neuroner, cilier der strækker sig fra de tilstødende dendritiske drejeknapper blande. Denne sammenblanding resulterer i en tilfældig blanding af cilier fra forskellige neuroner, der udtrykker forskellige former af olfaktoriske receptorer på overfladen af epitelet. Påvisningen og celleular tildeling af ciliære proteiner, som kun er til stede i en undergruppe af sensoriske neuroner er derfor vanskeligt i kryosektioner. Derudover nøjagtig lokalisering af sådanne proteiner langs cilia er næppe muligt, eftersom kryosektioner typisk tyndere end den gennemsnitlige længde af cilier.
For at muliggøre undersøgelse af ciliær lokalisering af hidtil karakteriserede membranproteiner i olfaktoriske neuroner, vi optimeret en en face forberedelse teknik, der gør det muligt detaljeret analyse af protein lokalisering i cilier. Kort fortalt er musen aflivet, og hovedet delt nær midterlinjen. Turbinates, nasal og frontale knogler fjernes for at blotlægge septum. Skillevæggen med olfaktoriske del af foringen epitel løsnes ved at skære alle forbindelser til næsehulen. Efter at skillevæggen i en petriskål fyldt med Ringers opløsning, epitel skrælles und overført til et overtrukket objektglas. Efter en kort fixation trin kan immunfarvning procedurer udføres, hvis håndteringen er så skånsom som muligt for at undgå skader på skrøbelige væv. Vi viser den opnåelige opløsning ved at sammenligne farvningen af to forskellige membranproteiner i olfaktoriske cilier i klassiske kryosektioner og i en face, der er beskrevet.
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
Petri dish | multiple suppliers | ||
Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |