Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme
Summary
Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
Abstract
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
Introduction
burun boşluğunda koku epiteli fare 6-10.000.000 bipolar koku duyu nöronları 1 içerir. Her koku nöron ifade 1.200 koku reseptör gen birini seçer. Koku tespiti daha sonra 4 olf koku spesifik G protein Gα üzerinden adenilat siklaz tip III (ACIII) 3 aktive bir koku reseptörü 2, bağlanma odorant başlar. siklik adenozin monofosfat (cAMP) 'de elde edilen artış açan bir nükleotid kapılı seçici olmayan katyon kanalı Ca2 + ve Na +, ve daha sonra, Ca girişine yol, (CNG) 2 + akışı, bir Ca + 2 aktif Cl açılmasına neden olan siklik – Kanal 5,6. dışarı doğru Cı Elde – akışı, yüksek hücre içi Cl kolaylaştırılır -, Na + / K + / Cl ile olası emme -, – ortak taşıyıcı NKCC1, konsantrasyon sabit Cl muhafazaCI – / HCO3 – değiştirici SLC4A1 ve belki ek henüz tespit edilmesi taşıyıcıları 6-8.
Bipolar koku nöronlar tek dalsız koku ampul doğrudan proje akson ve epitel yüzeyine uzanan ve özel bölmesi, dendritik topuzu gibi biten bir dendrit vardır. Kadar um 50-60 kadar bir uzunluğa ulaşabilir, bu topuz, 10-30 kirpikler itibaren, epitel yüzeyi 9 kaplayan mukus içine sızmak. Kanonik sinyal iletimi akışının Proteinler ağırlıklı bu kirpikler zarında lokalize edilmektedir. epitel artan duyusal yüzey Koku moleküllerini tespit etme yeteneğine güçlendirir. Nedeniyle duyusal nöronların yoğunluğunun, komşu dendritik kolları uzanan kirpikler içe. Epitelyumunun yüzeyi üzerine, koku reseptörlerinin farklı ifade eden farklı nöron gelen kirpikler rastgele karışımı içinde bu karışmasının sonucu. algılama ve hücreduyusal nöronların bir alt kümesi, sadece mevcut siliyer proteinlerin nitlerin ayırma cryosections de zordur. Halinde kriyoseksiyonlar kirpikler ortalama uzunluğundan daha tipik olarak daha ince olduğu için ek olarak, kirpikler boyunca bu proteinlerin kesin yeri, hemen hemen mümkün değildir.
Koku nöronlarda kadar uncharacterized membran proteinlerinin siliyer lokalizasyonu soruşturma etkinleştirmek için, biz kirpikler protein lokalizasyonu detaylı analizini sağlayan bir tr yüz hazırlama tekniklerini optimize. Kısaca, fare kurban ve baş orta hatta yakın bölünür. Kıkırdakçıklar burun ve frontal kemik septum maruz bırakmak için çıkarılır. astar epitel koku kısmı ile septum burun boşluğuna tüm bağlantıları keserek gevşetilir. Ringer çözeltisi ile doldurulmuş bir petri kabına septum konulduktan sonra, epitel kaplanmış bir cam slayt aktarılır und soyulur. Kısa bir fixat ardındantaşıma kırılgan doku hasarı önlemek için mümkün olduğunca nazik ise iyon adım, immün işlemleri yapılabilir. Biz klasik cryosections ve tarif tr yüz hazırlık koku kirpikler iki farklı membran proteinlerinin boyama karşılaştırarak elde çözünürlük göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
