Metazoan मॉडल जीव का प्रयोग फैल और विषाक्तता prion-तरह प्रोटीन की जांच कर<em> सी। एलिगेंस</em
Summary
Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.
Abstract
Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.
Introduction
अल्जाइमर रोग (ई), पार्किंसंस रोग (पीडी), पार्श्व काठिन्य (ए एल एस), और संक्रामक Spongiform encephalopathies (TSEs) सहित कई neurodegenerative रोगों, एकत्रीकरण की आशंका वाले प्रोटीन के साथ जुड़े रहे हैं और इसलिए सामूहिक रूप से प्रोटीन misfolding विकारों (PMDs के रूप में जाना जाता है )। वे दोनों मनुष्यों और पशुओं के एक में संक्रामक हो सकता है कि में TSEs या prion रोगों PMDs की एक अद्वितीय वर्ग का गठन। आणविक स्तर पर, prions की भर्ती और रोग β-शीट-अमीर पीआरपी एस सी रचना 2,3 में मोनोमेरिक α-कुण्डल युक्त मेजबान इनकोडिंग सेलुलर पीआरपी (पीआरपी सी) में कनवर्ट करके पेश करता है। आत्म प्रचार प्रोटीन समुच्चय भी स्तनधारी prions 4,5 के साथ महत्वपूर्ण विशेषताओं का हिस्सा है, जो कवक, में पहचान की गई है। इसके अतिरिक्त, स्तनधारी prions सेल के लिए सेल से चलती करने में सक्षम हैं और भोले कोशिकाओं 6,7 संक्रमित।
PMDs अन्य संगठनों जबकिएर TSEs संक्रामक नहीं कर रहे हैं, की तुलना में वे prion रोगों 8,9 के साथ एक आम रोगजनक सिद्धांत को साझा करें। PMDs में से प्रत्येक से जुड़ा हुआ प्रोटीन संरचना या समारोह में संबंधित नहीं कर रहे हैं, वे एक crystallization-तरह की प्रक्रिया के माध्यम से सभी फार्म समुच्चय एकल कहा जाता है या polymerization के वरीयता प्राप्त; इसके अलावा प्रोटीन बीज उनके घुलनशील isoforms 2,10,11 भर्ती से बढ़ता है। आत्म-प्रचार करने के लिए दक्षता एक साथ इस तरह के आणविक संरक्षिकाओं के रूप में अतिरिक्त सेलुलर कारकों के साथ अंततः कुल न्यूक्लिएशन, बोने, विखंडन और 12-15 के प्रसार की दरों का निर्धारण, जो प्रोटीन का आंतरिक गुणों पर निर्भर करता है, विवो में बदलता है। इसलिए, प्रोटीन एकत्रीकरण के कुशल प्रचार की अनुमति देता है कि इन कारकों के बीच एक अच्छा संतुलन वहां मौजूद होना चाहिए। केवल कुछ amyloidogenic समुच्चय एक prion की विशेषताओं बंदरगाह, और इस तरह नहीं सभी PMDs संक्रामक क्यों कर रहे हैं यह भी समझा सकता है। Prions 'शीर्ष कलाकारों ओ' का प्रतिनिधित्व करने लगते हैंउन्हें PMDs 8,13 अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बना देता है जो स्वयं नकल प्रोटीन समुच्चय के एफए व्यापक स्पेक्ट्रम,।
दिलचस्प, रोग संबंधी समुच्चय के साथ जुड़े विषाक्तता अक्सर एक गैर सेल स्वायत्त घटक 16,17 है। यह है कि वे केवल कोशिकाओं जीन प्रदर्शनी विशिष्ट फेनोटाइप व्यक्त तात्पर्य है कि जो एक सख्ती सेल स्वायत्त प्रभाव, के विपरीत, इसी जीन व्यक्त नहीं करते कि पड़ोसी कोशिकाओं को प्रभावित है कि इसका मतलब है। इस compellingly ऊतक विशेष अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शन या neurodegenerative रोगों 18-26 के कई मॉडल में संबंधित प्रोटीन के नीचे दस्तक गया था। विभिन्न तंत्रों कम पोषक तत्वों की आपूर्ति, न्यूरोनल संकेतन में असंतुलन, ग्लूटामेट excitotoxicity, और neuroinflammation 16,27,28 सहित PMDs में इस गैर-सेल स्वायत्त विषाक्तता, के लिए एक आधार के रूप में सुझाव दिया गया है। इसके अलावा, कोशिकाओं के बीच इस बीमारी से जुड़े समुच्चय के एक prion आंदोलन की तरह mighटी इस पहलू 29,30 करने के लिए योगदान करते हैं। बढ़ती सबूत prions के अलावा अन्य प्रोटीन समावेशन विशेषता कई PMDs 30-36 में मनाया विकृति विज्ञान के प्रसार को समझा जा सकता है, जो सेल के लिए सेल से संचारित कर सकते हैं कि पता चलता है। हालांकि, यह अभी तक रोग प्रोटीन की कहनेवाला आंदोलन और पड़ोसी कोशिकाओं पर विषाक्त प्रभाव के बीच एक स्पष्ट कारण लिंक है कि क्या वहाँ निर्धारित किया गया है। इसलिए, सेल करने वाली सेल ट्रांसमिशन और गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता आबाद कि सेलुलर रास्ते में से एक बेहतर समझ उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए आवश्यक है और आवश्यक है। हालांकि, मेटाजोअन में misfolded प्रोटीन की सेल करने वाली कोशिका संचरण को प्रभावित है कि प्रसार और सेलुलर कारकों prion-तरह के कई पहलुओं को अच्छी तरह से जीवधारी के स्तर पर विशेष रूप से, समझ नहीं रहे हैं।
Caenorhabditis एलिगेंस निमेटोड क्षमता के लिए प्रदान करते हैं कि कई फायदे हैं prion तरह SPREADI के नए पहलुओं की खोजमेटाजोअन 17 में एनजी। यह vivo में रहने वाले जीव में की fluorescently टैग प्रोटीन पर नज़र रखने के लिए अनुमति देता है, पारदर्शी है। इसके अलावा, इस बीमारी से प्रभावित कई सेलुलर और शारीरिक प्रक्रियाओं मानव को कीड़े से संरक्षित हैं, और सी कर रहे हैं एलिगेंस भी आनुवंशिक जोड़तोड़ और आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण 37-39 की एक विस्तृत विविधता के लिए उत्तरदायी है। वास्तव में 959 दैहिक कोशिकाओं को अभी भी मांसपेशी, न्यूरॉन्स और आंत सहित कई विशिष्ट प्रकार के ऊतकों की है कि एक साधारण शरीर योजना के साथ वयस्क द्विलिंग बनाते हैं।
सी में एक नया prion मॉडल स्थापित करने के लिए एलिगेंस, हम कीड़े 4,40 में कोई ज्ञात अंतर्जात prion प्रोटीन के बाद से वहाँ exogenously, अच्छी तरह से विशेषता glutamine / asparagine (क्यू / एन) साइटोसोलिक खमीर prion प्रोटीन Sup35 के अमीर prion डोमेन समुद्री मील दूर व्यक्त करने के लिए चुना है। खमीर prions prion प्रतिकृति 41-44 के बुनियादी तंत्र elucidating में अमूल्य किया गया है। इसके अलावा, समुद्री मील दूर देवदार हैस्तनधारी सेल संस्कृति 45,46 में एक prion का पूरा जीवन चक्र पुनरावृत्ति दिखाया गया है कि सेंट साइटोसोलिक prion की तरह प्रोटीन। इसी तरह, सी में व्यक्त जब एलिगेंस, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता और की उपस्थिति के विघटन सहित 40। समुद्री मील दूर एकत्रीकरण एक गहरा विषाक्त phenotype के साथ जुड़े थे खमीर कोशिकाओं और prion जीव विज्ञान के प्रदर्शित प्रमुख विशेषताओं की तुलना metazoan कोशिकाओं में प्रचार के लिए विभिन्न आवश्यकताओं के लिए उल्लेखनीय अच्छी तरह से अपनाया Sup35 prion डोमेन सेलुलर स्तर पर विभिन्न भोजी संबंधित पुटिकाओं, साथ ही भ्रूण और लार्वा गिरफ्तारी, विकास में देरी, और जीवधारी स्तर पर प्रोटीन तह पर्यावरण के एक बड़े पैमाने पर अशांति। Strikingly, prion डोमेन transgene व्यक्त नहीं किया गया था, जिसमें पड़ोसी ऊतकों को प्रभावित करने, सेल स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता दर्शाती है। इसके अलावा, के भीतर और कोशिकाओं के बीच prion डोमेन के vesicular परिवहन वास्तविक समय निगरानी रखी जाती है <उन्हें> विवो 40 में।
यहाँ हम सी में prion की तरह प्रचार-प्रसार की जांच करने के लिए कैसे का वर्णन एलिगेंस। हम समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग prion डोमेन युक्त vesicles के intra- और कहनेवाला परिवहन पर नजर रखने के लिए समझाना होगा। हम ऊतक विशेष तह सेंसर का उपयोग पर जोर देना और सर्वत्र सेलुलर फिटनेस पर सेल स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए तनाव संवाददाताओं व्यक्त करेंगे। अंत में, हम prion प्रेरित विषाक्तता के नए संशोधक की पहचान करने के लिए एक हाल ही में प्रदर्शन किया जीनोम चौड़ा शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) स्क्रीन की प्रक्रिया का वर्णन करेंगे। संयोजन में, इन तरीकों में प्रोटीन की कहनेवाला आंदोलन और उनके गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता में शामिल आनुवंशिक रास्ते अलग तंग करने के लिए कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित विधियों के प्रसार को वर्णन करने में मदद मिलेगी और prion की तरह प्रोटीन की जटिल सेल स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता। हमने हाल ही में एक एकत्रीकरण-प्रवण साइटोसोलिक prion डोमेन एक भोजी से संब…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).
Materials
| Reagent | |||
| Nanosphere size standards 100 nm | ThermoScientific | 3100A | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer RNAi library | Source BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/ |
|
| Equipment | |||
| Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC | ThermoScientific | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60 |
| 96 pin replicator | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| HiGro high-capacity, incubating shaker | Digilab | http://www.digilabglobal.com/higro | |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
| Biomek FX AP96 Automated Workstation | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Innova44 shaker | New Brunswick | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389 |
|
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera | Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| Spinning Disc AF Confocal Microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Falcon 4M60 camera | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| Software | |||
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
| Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
| ImageJ | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| wrMTrck plugin for ImageJ | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
| C. elegans strains | |||
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | Morimoto lab | available from our laboratory | |
| See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains |
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