Человек плюрипотентных стволовых клеток на основе Экспериментальная токсичность Анализы для химической безопасности Скрининг и системной биологии генерации данных
Summary
Протоколы описывают два в пробирке тест-систем развития токсичности (УКК и UKN1) на основе эмбриональных стволовых клеток человека и транскриптом исследований. Тестовые системы прогнозирования с развитием токсичности человека, и может способствовать сокращению исследования на животных, затрат и времени, необходимого для тестирования химической безопасности.
Abstract
Эффективные протоколы дифференцировать человека плюрипотентных стволовых клеток в различных тканях в сочетании с -omics технологии открыли новые горизонты для экстракорпорального токсичности тестирования в потенциальных лекарственных препаратов. Чтобы обеспечить прочную научную основу для таких анализов, это будет иметь важное значение для получения количественной информации о времени ходе развития и на основных регуляторных механизмов по системной биологии подходов. Два теста были поэтому настроены здесь этих требований. В тестовой системе УКК, человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) (или другие плюрипотентные клетки) оставляют самопроизвольно дифференцировать в течение 14 дней в эмбриональных телец, чтобы поколение клеток всех трех зародышевых листков. Эта система повторяет основные этапы раннего эмбрионального развития человека, и он может предсказать человеческое конкретных раннего эмбрионального токсичность / тератогенность, если клетки подвергаются воздействию химических веществ во время дифференцировки. Тест-система UKN1 основана на дифференциации ЭСК в populatион нейроэктодермального предшественников (НЭП) клетки в течение 6 дней. Эта система повторяет раннюю развития нервной и прогнозирует раннего развития нейротоксичности и эпигенетические изменения, запускаемые химическими веществами. Обе системы, в сочетании с транскриптом микрочипов исследований, подходят для идентификации биомаркеров токсичности. Кроме того, они могут быть использованы в комбинации для генерации входных данных для анализа системной биологии. Эти тест-системы имеют преимущества перед традиционными токсикологических исследований, требующих больших объемов животных. Тестовые системы могут способствовать снижению затрат на разработку лекарств и оценки химической безопасности. Их сочетание проливает свет на особенности соединений, которые могут повлиять на развитие нервной системы в частности.
Introduction
Способность человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК), чтобы дифференцироваться в различные типы клеток открыл новую эру тестирования в пробирке токсичность 1, моделирования болезни и регенеративной медицины 2. Стволовые клетки наделены способностью к самовоспроизведению, чтобы сохранить их плюрипотентных состояние и дифференцироваться в специализированные клетки 3,4. Свойства чЭСК (способностью дифференцироваться во все основные типы клеток) находятся также в других человеческих плюрипотентных стволовых клеток, таких как человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) или клеток, полученных с помощью ядерного переноса 5. Например, много различных линий чЭСК были дифференцированы в нейроны 6, 7 клеток почек, клеток нервного гребня 8, 9-12 кардиомиоцитов, или гепатоцитов, как клетки 13,14. Кроме того, чЭСК могут спонтанно дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков 15-18 в эмбриональных телец (EBS) 19,20. ЕАрли эмбриональное развитие регулируется с помощью дифференциальной экспрессии различных генов, связанных с различными зародышевых листков, которые были захвачены на уровне мРНК в транскриптомики использованием микрочипов технологии 15. Эти усилия привели к созданию органов конкретных токсикологических моделей, основанных на чЭСК / hiPSC и анализа транскриптомика (для обзора см 21,22). Эти модели имеют преимущества по сравнению с традиционным использованием лабораторных животных для токсикологических исследований, как доклинических исследований с использованием лабораторных животных не всегда прогнозирования человеческой безопасности. Препарат индуцированной токсичности, возникающие у пациентов часто связаны с метаболическими или сигнальных процессов, отличающихся между людьми и экспериментальных животных. Разница виды помешала надежное раннее обнаружение развития токсичности в организме человека, и, например, препаратов, таких как талидомид 23,24 и 25,26 диэтилстильбэстрола были изъяты с рынка из-за тератогенного. ТалиDomide не проявил никакого токсического воздействия на развитие крыс или мышей. Окружающей среды химических веществ, таких как метил ртути привело к 27 пренатального развития токсичности по отношению к нервной системы у различных видов, но человека проявления было трудно смоделировать на животных. Для решения этой проблемы вопросов видовой, ученые, работающие в различных проектах на основе стволовых клеток, как ReProTect, ESNATS, детектив и т.д. занимаются развитием различных моделей для эмбрионального токсичности, нейротоксичности, кардиотоксичности, гепатотоксичность и нефротоксичность, используя человеческие токсикантов, подозреваемых в влиять на людей. В соответствии с Европейской консорциум проекта «Эмбриональные стволовые клетки на основе романа альтернативной тестирования стратегий (ESNATS)" пять тест-системы были созданы. Одно испытание системы так называемый УКК (U niversitäts к linikum К OLN) Тест-система частично захватывает раннего эмбрионального развития человека. В этом System человеческие эмбриональные клетки H9 дифференцированы в трех зародышевых листков (эктодермы, энтодермы и мезодермы) 15 и зародыш слой конкретные подписи были захваченных транскриптомики профиль с помощью микрочипов платформу Affymetrix. Различные токсиканты развития как талидомид 28, вальпроевой кислотой, метилртути 16,17, или цитозинарабинозидом 15 были протестированы в этой системе, и ядовитых конкретных генов подписи были получены. Во втором тестовой системе, так называемый UKN1 (U niversity из К onsta п г) тест-системы 1, клетки H9 дифференцированы в клетки-предшественники нейроэктодермальная (NEP) в течение 6 дней. Это свидетельствует высокий уровень экспрессии нейронных маркеров генов, таких как Pax6 и Otx2. Во дифференциации в течение 6 дней, НЭП клетки были подвержены развития нервно-токсикантов, таких как VPA, метилртути. Токсикант конкретных де-регулируется профили транскриптомика были obtaiопределяется как хорошо с помощью микрочипов платформу Affymetrix 16,29.
Новое видение токсикологии 21-го века предусматривает, что тест-системы не только дать фенотипические описания как гистопатологии в естественных условиях, или изменения транскриптом в конце долгосрочных ядовитых инкубации. Это предполагает, что, скорее анализы обеспечивают механистической информации 3, и что эта информация может быть отображена в так называемые неблагоприятные исходы пути (АОП), которые обеспечивают научное обоснование для опасных последствий 30. Для обеспечения такой информации, тест-системы, применяемые должны быть высоко контроль качества 31, как, например, документально надежных стандартных операционных процедур. Кроме того, время-зависимые изменения должны быть отображены с высоким разрешением. Это требует тестирования систем с синхронизированными изменений 32. Тестовые системы UKN1 и УКК, описанные здесь, были оптимизированы для этих требований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Традиционные подходы к токсикологической тестирования привлекать широкие исследования на животных, таким образом, делая тестирование дорого и отнимает много времени. Кроме того, из-за различий в межвидовых доклинические исследования безопасности животных не всегда справедливо для ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani and Cornelia Böttinger for excellent technical support. This work was supported by grants from the German Research Foundation (RTG 1331) and the German Ministry for Research (BMBF).
Materials
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| Vbottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin- Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio- sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 | |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| List of equipment. | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven – 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update – Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy – A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity – Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought … considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
