Die Nutzung der Bioorthogonale inversem Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für Pretargeted PET Imaging

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

Im Laufe der letzten dreißig Jahre, Positronenemissionstomographie (PET) ist ein unverzichtbares klinisches Werkzeug bei der Diagnose und Behandlung von Krebs. Antikörper werden seit langem als vielversprechende Vektoren für die Abgabe von Positronen emittierende Radioisotope zu Tumoren durch ihre vorzügliche Affinität und Spezifität für-Biomarkern. ^1,2 jedoch die relativ langsame in vivo pharmakokinetischen Eigenschaften von Antikörpern sieht die Verwendung von Radioisotopen mit mehrtägiges physikalische Halbwertszeiten. Im Gegensatz zu Teilkörper-CT-Scans – – in Energiedosen in jedem Teil des Körpers Ergebnis Diese Kombination kann hohe Strahlendosen auf die Nichtzielorgane von Patienten, eine wichtige Komplikation, die von besonderer klinischer Bedeutung ist, da Radioimmunkonjugate intravenös injiziert und damit ergeben unabhängig von den abgefragten Geweben.

Um dieses Problem zu umgehen, hat erhebliche Anstrengungen unternommen worden, um die develo gewidmetpment der PET-Bildgebung Strategien, die die Radioisotops und der Targeting-Einheit zu entkoppeln, wodurch die Nutzung der vorteilhaften Eigenschaften von Antikörpern und gleichzeitig Sockel ihrer intrinsischen pharmakokinetischen Einschränkungen. Diese Strategien – am häufigsten genannt Pretargeting oder mehrstufige Targeting – typischerweise vier Schritte: (1) die Verabreichung eines Antikörpers, der zur Bindung sowohl ein Antigen und ein Radioligand; (2) die Anreicherung des Antikörpers in das Zielgewebe und seine Clearance aus dem Blut; (3) die Verabreichung eines kleinen Moleküls Radioligand; und (4) die in vivo-Ligation des Radioliganden an den Antikörper, gefolgt durch die schnelle Clearance von überschüssigem Radioligand. ^3-8 In einigen Fällen kann ein zusätzlicher Klärungsmittel zwischen den Schritten 2 und 3, um die Ausscheidung von jedem Antikörper beschleunigen spritzt Dazu ist es noch, den Tumor zu binden und im Blut bleibt. ⁵

Im Großen und Ganzen two Arten von Pretargeting Strategien sind besonders häufig in der Literatur. Während beide erfolgreich in präklinischen Modellen nachgewiesen, sie besitzen auch Schlüssel Einschränkungen, die ihre klinische Anwendbarkeit behindert haben. Die erste Strategie beruht auf der hohen Affinität zwischen Streptavidin-konjugierte Antikörper und Biotin-modifizierten Radiomarkierungen; jedoch die Immunogenität der Streptavidin-modifizierten Antikörper erwies sich eine beunruhigende Problem hinsichtlich der Übersetzung sein. ^5,6,9,10 Die zweite Strategie, die im Gegensatz dazu verwendet bispezifischen Antikörpern, die genetisch manipuliert wurden, um sowohl eine Krebs binden Biomarker Antigen und ein kleines Molekül radiomarkierten Haptens. ^3,11-14 Während dieser letztere Weg ist sicherlich kreativ, wird ihre breite Anwendbarkeit durch die Komplexität, die Kosten und die fehlende Modularität des Systems begrenzt.

In letzter Zeit entwickelt und veröffentlicht eine pretargeted PET Methodik, die auf dem inversem Elektronenbedarf Diels-Alder (I wirEDDA) Cycloaddition zwischen trans -Cycloocten (TCO) und Tetrazin (Tz;. Abbildung 1) ¹¹ Während der Reaktion selbst ist seit Jahrzehnten bekannt, hat IEDDA Chemie eine Renaissance in den letzten Jahren als Klick-Chemie Biokonjugation Technik erlebt, wie dargestellt die faszinierende Arbeit der Gruppen von Ralph Weissleder, Joseph Fox und Peter Conti unter anderem. ^12-15 Die IEDDA Cycloaddition wurde in einer Vielzahl von Einstellungen angewendet wurden, einschließlich Fluoreszenz-Imaging mit Peptiden, Antikörpern, und Nanopartikel sowie die nuklearmedizinische Bildgebung . mit beiden Radiohalogene und Radiometalle ^16-26 Die Ligation ist ertragreiche, saubere, schnelle (k _1> 30000 M ^-1 s ^-1), selektiver und – entscheidend -. bioorthogonale ²⁷ Und während eine Reihe von Arten von Klick-Chemie – einschließlich Cu-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, spannungskatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition und Staudinger ligtionen -. sind bioorthogonale als gut, es ist die einzigartige Kombination von schnellen Reaktionskinetik und Bioorthogonalität die IEDDA Chemie macht so gut geeignet, um Pretargeting Anwendungen in ganzen Organismen ^28,29 In diesem Sinne ist es wichtig zu beachten, dass dem jüngsten Bericht von unserem Labors war nicht der erste, IEDDA Chemie Pretargeting gelten: der erste Bericht über pretargeted Bildgebung mit IEDDA entstand aus der Arbeit von Rossin, et al und enthielt eine SPECT Methodik unter Verwendung einer ¹¹¹ In-markierten Tetrazin ^30..

Wie wir oben diskutiert, hat der Pretargeting Methodik vier ziemlich einfachen Schritten (Abbildung 2). In dem Protokoll zur Hand, wird ein pretargeted Strategie für die PET-Bildgebung von Darmkrebs, der eine ⁶⁴ Cu-NOTA-markierten Tetrazin Radioliganden und einem TCO-modifizierte Konjugat des Antikörpers huA33 beschäftigt beschrieben werden. Ist einer seiner gr jedoch letztendlich die Modularität dieser Methodikißt Vermögen als trans -Cycloocten Rest kann ein beliebiges nicht-internalisierenden Antikörper angehängt werden, und das Tetrazin kann auf eine Vielzahl von radioaktiven Reporter befestigt werden.

Protocol

ETHIK STATEMENT: Alle beschriebenen In-vivo-Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt. 1. Synthese von Tz-Bn-NOTA In einem kleinen Reaktionsgefß löst man 7 mg NH 2 -Bn-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) in 600 & mgr; l NaHCO 3 Puffer (0,1 M, pH 8,1). Überprüfen Sie…

Representative Results

Die ersten drei Schritte des Experiments – die Synthese von Tz-Bn-NOTA, die Konjugation von TCO zu huA33 und der radioaktiven Markierung des Tz-Bn-NOTA konstruieren (Abbildungen 3 und 4) – sind sehr zuverlässig. Im Fall der oben beschriebenen Verfahren wurde die Tz-Bn-NOTA Konstrukt in hoher Ausbeute und Reinheit hergestellt. Die huA33 Antikörper wurde mit 4,2 ± 0,6 TCO / mAb modifiziert und Tz-Bn-NOTA wurde radioaktiv markiert und mit 64 Cu, um das gereinigte Radioligand …

Discussion

Der Hauptvorteil dieser pretargeted PET Strategie ist, dass es in der Lage ist die Abgrenzung von Tumoren mit Ziel-zu-Hintergrund-Bildkontrast bei nur einem Bruchteil der direkt markierten Antikörpern produziert Hintergrund Strahlungsdosis. Zum Beispiel wird in dem hier beschriebenen Darmkrebs Abbildungssystem, Daten von akuten Bioverteilung Experimente wurden verwendet, um die Dosimetrie Berechnungen für die ⁶⁴ Cu-Basis Pretargeting Strategie zusammen mit direkt markiertem ⁶⁴ Cu-NOTA-huA33 und <…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C