רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

בשלושים השנים האחרונות, טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) הפכה לכלי הכרחי קליני באבחון ובטיפול בסרטן. נוגדנים כבר מזמן נחשבים וקטורים מבטיחים עבור המשלוח של רדיואיזוטופים פולטות פוזיטרונים לגידולים בשל זיקתם המעודנת והספציפיות לסמנים לסרטן. ^1,2 הפרמקוקינטיקה עם זאת, איטית יחסית in vivo של נוגדנים מחייבת שימוש ברדיואיזוטופים עם multi-יום מחצית חיים פיזיים. שילוב זה יכול להניב מינוני קרינה גבוהה לאיברים שאינם היעד של חולים, סיבוך חשוב שיש משמעות קלינית בפרט מאז radioimmunoconjugates מוזרק לוריד ולכן – בניגוד סריקות CT הגוף חלקיים – תוצאה במינונים שקועים בכל חלק של הגוף, ללא קשר לרקמות נחקרו.

כדי לעקוף בעיה זו, מאמץ משמעותי הוקדשה לdevelopment של אסטרטגיות ההדמיה PET שלנתק את הרדיו-איזוטופי ומחצית המיקוד, וכך למנף את מאפייני יתרון של נוגדנים תוך עוקפים בו-זמנית מגבלות pharmacokinetic הפנימיות שלהם. אסטרטגיות אלה – לרוב מכונות pretargeting או מיקוד רב שלבי – בדרך כלל להעסיק ארבעה שלבים: (1) מתן נוגדן מסוגל להיקשר גם אנטיגן וradioligand; ההצטברות של הנוגדן ברקמת המטרה והפינוי שלה מהדם (2); (3) הניהול של radioligand מולקולה קטנה; ו- (4) קשירת in vivo של radioligand לנוגדן ואחרי הפינוי המהיר של radioligand העודף. ^3-8 בחלק מהמקרים, סולק נוסף מוזרקת בין השלבים 2 ו -3 כדי להאיץ את ההפרשה של כל נוגדן שעדיין לא מחייבים את הגידול ונשאר בדם. ⁵

באופן כללי, twסוגי o אסטרטגיות pretargeting הם נפוצים ביותר בספרות. בעוד שני הוכיחו מוצלחים במודלים פרה, הם גם בעלי מגבלות עיקריות שמנעו היישום הקליני שלהם. האסטרטגיה הראשונה מסתמכת על הזיקה הגבוהה בין נוגדני streptavidin מצומדות- וradiolabels-שונה ביוטין; עם זאת, immunogenicity של הנוגדנים-שונה streptavidin הוכיח להיות בעיה מדאיגה בכל קשור לתרגום. ^5,6,9,10 האסטרטגיה השנייה, לעומת זאת, מעסיקה נוגדני bispecific כי כבר-מהונדס גנטי כדי לאגד את שני סרטן אנטיגן הסמן הביולוגי וhapten radiolabeled מולקולה קטנה. ^3,11-14 בעוד המסלול אחרון זה בהחלט יצירתי, תחולתו הרחבה הוא מוגבלים על ידי מורכבות, חשבון, וחוסר המודולריות של המערכת.

לאחרונה, פיתחנו ופרסמנו מתודולוגיה ההדמיה PET pretargeted מבוססים על ביקוש האלקטרון ההפוך דילס-Alder (אניאדה) תגובת cycloaddition בין -cyclooctene טרנס (TCO) וtetrazine (טז;. איור 1) ¹¹ בעוד התגובה עצמו כבר ידוע במשך עשרות שנים, הכימיה IEDDA חוותה רנסנס בשנים האחרונות כטכניקת bioconjugation כימיה לחץ, כפי שמודגם על ידי העבודה המרתקת של הקבוצות של ראלף Weissleder, יוסף פוקס, ופיטר Conti בין יתר. ^12-15 cycloaddition IEDDA יושם במגוון רחב של הגדרות, כולל הדמיה הקרינה עם פפטידים, נוגדנים, וחלקיקים, כמו גם הדמיה גרעינית . עם שני radiohalogens וradiometals ^16-26 קשירה היא גבוהה מניב, נקייה, מהירה (k _1> 30,000 M ^-1 שניות ^-1), סלקטיבי, ו– ביקורתי -. Bioorthogonal ²⁷ ובעוד מספר סוגים של כימיה לחץ – כולל cycloadditions-זרז Cu-אזיד alkyne, cycloadditions אזיד-alkyne-קידם מתח, וStaudinger ligations -. גם הוא bioorthogonal, זה שילוב הייחודי של קינטיקה מהירה תגובה וbioorthogonality שעושה כימיה IEDDA גם כך מתאים לpretargeting יישומים בכל האורגניזמים ^28,29 לאורך שורות אלה, חשוב לשים לב כי לאחרונה דווח משלנו מעבדות לא היו הראשונה ליישם כימיה IEDDA לpretargeting: הדו"ח הראשון של הדמיה pretargeted עם IEDDA נבעו מהעבודה של Rossin, et al והשתתפות מתודולוגיה SPECT העסקת ¹¹¹ tetrazine שכותרתו ב- ^30..

כפי שהזכרנו לעיל, יש מתודולוגיה pretargeting ארבעה צעדים פשוטים למדי (איור 2). בפרוטוקול ביד, אסטרטגית pretargeted להדמית PET של סרטן מעי גס שמעסיקה radioligand ⁶⁴ שכותרתו Cu-NOTA tetrazine והמצומד שונה-TCO של נוגדן huA33 תתואר. עם זאת, בסופו של המודולריות של מתודולוגיה זו היא אחת מגרנכסי eatest, כמחצית -cyclooctene טרנס יכולים להיות מצורפים לכל נוגדן שאינה הפנמה, וtetrazine יכול להיות מחובר למגוון רחב של כתבים רדיואקטיביים.

Protocol

מסר של אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים in vivo תיארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ולפי ההנחיות האתיות של Memorial Sloan Kettering Cancer Center המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC). 1. סינתזה של TZ-BN-NOTA <li style=";text-align:r…

Representative Results

שלושה שלבים הראשוניים של הניסוי – הסינתזה של TZ-BN-נוטה, נטיה של TCO לhuA33, וradiolabeling של TZ-BN-NOTA לבנות (איורים 3 ו -4) – הם אמין ביותר. במקרה של ההליך הנ"ל, מבנה TZ-BN-NOTA היה מסונתז בתשואה גבוהה וטוהר. נוגדן huA33 היה שונה עם 4.2 ± 0.6 TCO / מב, וTZ-BN-NOTA היה radiolabeled עם 64 Cu …

Discussion

היתרון העיקרי של אסטרטגית ההדמיה PET pretargeted הזה הוא שהוא מסוגל התוויית גידולים עם ניגודיות תמונת יעד לרקע בחלק קטן בלבד של מינון קרינת רקע המיוצר על ידי נוגדנים שכותרתו ישירות. לדוגמא, במערכת ההדמיה סרטן המעי הגס שתוארה כאן, נתונים מניסויי biodistribution חריפים הועסקו כדי לב…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C