El aprovechamiento de la demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder Cicloadición para Pretargeted TEP

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

Durante los últimos treinta años, la tomografía por emisión de positrones (PET) se ha convertido en una herramienta clínica indispensable en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Los anticuerpos han sido considerados vectores prometedores para la entrega de radioisótopos emisores de positrones a los tumores debido a su exquisita afinidad y especificidad para biomarcadores de cáncer. ^1,2 farmacocinética Sin embargo, la relativamente lentos in vivo de anticuerpos ordena el uso de radioisótopos con multi-día semividas físicas. Esta combinación puede producir altas dosis de radiación a los órganos que no son objeto de los pacientes, una complicación importante que es de particular importancia clínica ya radioinmunoconjugados se inyectaron por vía intravenosa, por lo que – a diferencia de las tomografías computarizadas cuerpo parciales – resultado en dosis absorbidas en cada parte del cuerpo, independientemente de los tejidos interrogados.

Para evitar este problema, esfuerzo significativo se ha dedicado a la desallo de estrategias de formación de imágenes de PET que desacoplar el radioisótopo y el resto de dirección, aprovechando así las propiedades ventajosas de anticuerpos bordeando simultáneamente sus limitaciones intrínsecas farmacocinéticos. Estas estrategias – más a menudo denominados predireccionamiento o focalización de varios pasos – emplean típicamente cuatro pasos: (1) la administración de un anticuerpo capaz de unirse tanto un antígeno y un radioligando; (2) la acumulación del anticuerpo en el tejido diana y su aclaramiento de la sangre; (3) la administración de una pequeña molécula de radioligando; y (4) la ligación in vivo del radioligando con el anticuerpo seguido por la rápida eliminación del exceso de radioligando. ^3-8 En algunos casos, se inyecta un agente de compensación adicional entre los pasos 2 y 3 con el fin de acelerar la excreción de cualquier anticuerpo Sin embargo, eso tiene que obligar a la tumor y permanece en la sangre. ⁵

En términos generales, twtipos o de estrategias predireccionamiento son más frecuentes en la literatura. Mientras que ambos han demostrado su eficacia en modelos preclínicos, también poseen limitaciones clave que han impedido su aplicabilidad clínica. La primera estrategia se basa en la alta afinidad entre los anticuerpos conjugados con estreptavidina y radiomarcadores modificados con biotina; Sin embargo, la inmunogenicidad de los anticuerpos modificados con estreptavidina ha demostrado ser un problema preocupante con respecto a la traducción. ^5,6,9,10 La segunda estrategia, en cambio, emplea anticuerpos biespecíficos que han sido genéticamente modificados para-unirse tanto un cáncer antígeno biomarcador y un pequeño hapteno marcado radiactivamente molécula. ^3,11-14 Mientras que esta última ruta es ciertamente creativo, su amplia aplicabilidad está limitada por la complejidad, gasto, y la falta de modularidad del sistema.

Recientemente, hemos desarrollado y publicado una metodología de formación de imágenes PET pretargeted basado en la demanda de electrones inversa Diels-Alder (IEdda) reacción de cicloadición entre -cyclooctene trans (TCO) y tetrazina (Tz;. Figura 1) ¹¹ Mientras que la reacción misma se conoce desde hace décadas, la química IEDDA ha experimentado un renacimiento en los últimos años como una técnica bioconjugación de química, como se ilustra en el fascinante trabajo de los grupos de Ralph Weissleder, Joseph Fox, y Peter Conti entre otros. ^12.15 El IEDDA cicloadición se ha aplicado en una amplia gama de entornos, incluyendo imágenes de fluorescencia con péptidos, anticuerpos, y nanopartículas, así como imágenes nucleares . con ambas radiohalogens y radiometales ^16-26 La ligadura es de alto rendimiento, limpia, rápida (k _1> 30000 M ^-1 s ^-1), selectiva y – crítica -. bioorthogonal ²⁷ Y mientras que una serie de tipos de química modular – incluyendo cicloadiciones Cu-catalizada por azida alquino, cicloadiciones-azida alquino deformación-promovido y Staudinger ligciones -. bioorthogonal son, así, es la combinación única de la cinética de reacción rápidos y bioorthogonality que hace que la química IEDDA tan bien adecuado para el predireccionamiento aplicaciones en organismos enteros ^28,29 A lo largo de estas líneas, es importante tener en cuenta que el reciente informe de nuestro laboratorios no fue el primero en aplicar la química IEDDA a predireccionamiento: el primer informe de la imagenología pretargeted con IEDDA surgió del trabajo de Rossin, y otros, y contó con una metodología que emplea un SPECT ¹¹¹ tetrazina En marcado ^30..

Como ya comentamos anteriormente, la metodología predireccionamiento tiene cuatro pasos muy simples (Figura 2). En el protocolo a la mano, se describirá una estrategia pretargeted para la formación de imágenes PET de cáncer colorrectal que se emplea un ⁶⁴ marcado con Cu-NOTA radioligando tetrazina y un conjugado modificado-TCO del anticuerpo huA33. Sin embargo, en última instancia, la modularidad de esta metodología es uno de sus grcomieres activos, como el resto -cyclooctene trans se pueden adjuntar a cualquier anticuerpo no internalización, y la tetrazina se pueden unir a una amplia variedad de reporteros radiactivos.

Protocol

ÉTICA DECLARACIÓN: Todos los experimentos con animales en vivo descritos fueron realizados de acuerdo con un protocolo aprobado y bajo las directrices éticas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. Síntesis de Tz-Bn-NOTA En un pequeño recipiente de reacción, se disuelven 7 mg NH 2–Bn NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) en 600 l de NaHCO3 tampón (0,1 M, pH …

Representative Results

Los tres pasos iniciales del experimento – la síntesis de Tz-Bn-NOTA, la conjugación de TCO para huA33, y el radiomarcado del Tz-Bn-NOTA construyen (Figuras 3 y 4) – son altamente confiables. En el caso del procedimiento anterior, el constructo Tz-Bn-NOTA se sintetizó de alto rendimiento y pureza. El anticuerpo huA33 fue modificado con 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, y Tz-Bn-NOTA fue radiomarcado con 64 Cu para producir el radioligando purificada en> 99% de pureza radioquímica,&…

Discussion

La principal ventaja de esta estrategia de formación de imágenes PET pretargeted es que es capaz de delinear los tumores con contraste de la imagen-objetivo a fondo a sólo una fracción de la dosis de radiación de fondo producida por los anticuerpos marcados directamente. Por ejemplo, en el sistema de imágenes de cáncer colorrectal se describe aquí, se emplearon datos de los experimentos de biodistribución agudos para realizar cálculos de dosimetría para la estrategia de predireccionamiento a base de Cu ^6…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C