Utnyttja Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cykloaddition för Pretargeted PET Imaging

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

Under de senaste trettio åren har positronemissionstomografi (PET) blivit ett oumbärligt kliniskt verktyg vid diagnos och hantering av cancer. Antikroppar har länge ansetts lovande vektorer för leverans av positron-emitterande radioisotoper till tumörer på grund av deras utsökta affinitet och specificitet för cancer biomarkörer. ^1,2 emellertid den relativt långsamma in vivo farmakokinetik antikroppar mandat användning av radioisotoper med flera dagar fysiska halveringstider. Denna kombination kan ge höga stråldoser till de icke-målorgan för patienterna, en viktig komplikation som är av särskild klinisk betydelse, eftersom radioimmunoconjugates injiceras intravenöst och därför – till skillnad partiella kropps datortomografi – resultatet i absorberade doser i varje del av kroppen, oberoende av de avlästs vävnader.

För att kringgå detta problem, har betydande ansträngningar ägnats åt development PET imaging strategier som frikoppla radioisotop och måldelen därigenom utnyttja de fördelaktiga egenskaper antikroppar samtidigt lister deras inneboende farmakokinetiska begränsningar. Dessa strategier – oftast kallas pretargeting eller flerstegs inriktning – vanligtvis sysselsätter fyra steg: (1) administrering av en antikropp som kan binda både ett antigen och en radioligand; (2) ackumuleringen av antikropp i målvävnaden och dess clearance från blodet; (3) administrering av en liten molekyl radioligand; och (4) ligering in vivo av radioliganden till antikroppen, följt av den snabba elimineringen av överskott radioligand. ^3-8 I vissa fall är ett ytterligare renande ämne injiceras mellan stegen 2 och 3 i syfte att påskynda utsöndringen av varje antikropp som ännu binda tumören och förblir i blodet. ⁵

I stort sett, two typer pretargeting strategier är mest förekommande i litteraturen. Medan både har visat sig framgångsrika i prekliniska modeller, de har också viktiga begränsningar som har hindrat deras kliniska tillämpbarhet. Den första strategin är beroende av hög affinitet mellan streptavidinkonjugerat antikroppar och biotinmodifierade radiomarkörer; emellertid, har immunogeniciteten av de streptavidin-modifierade antikroppar visat sig vara ett oroande problem med avseende på translation. ^5,6,9,10 Den andra strategin, i kontrast, sysselsätter bispecifika antikroppar som har blivit genetiskt modifierade för att binda både en cancer biomarkör antigen och en liten molekyl radiomärkt hapten. ^3,11-14 Medan detta sistnämnda vägen är förvisso kreativ, är dess breda tillämplighet begränsad av komplexiteten, kostnaden och avsaknaden av modularitet hos systemet.

Nyligen, vi utvecklat och publicerat en pretargeted PET imaging metod som bygger på den omvända elektron efterfrågan Diels-Alder (IEDDA) cykloadditionsreaktion mellan trans -cyclooctene (TCO) och tetrazin (Tz;. Figur 1) ¹¹ Medan själva reaktionen har varit känt i årtionden, har IEDDA kemi upplevt en renässans på senare år som klickkemi biokonjugering teknik, vilket illustreras av fascinerande arbete av grupperna av Ralph Weissleder, Joseph Fox, och Peter Conti bl. ^12-15 Den IEDDA cykloadditionen har tillämpats i ett brett spektrum av inställningar, inklusive fluorescens avbildning med peptider, antikroppar och nanopartiklar samt kärnavbildning . med både radiohalogens och radiometaller ^16-26 Ligerings är högavkastande, ren, snabb (k _1> 30.000 M ^-1 sek ^-1), selektiv, och – kritiskt -. bioorthogonal ²⁷ Och medan ett antal typer av klickkemi – inklusive Cu-katalyserad azid-alkyn cykloadditioner, belastnings främjat azid-alkyn cykloadditioner och Staudinger LIGsamhet -. är bioorthogonal också, det är den unika kombinationen av snabba reaktionskinetik och bioorthogonality som gör IEDDA kemi så väl lämpad för pretargeting applikationer hela organismer ^28,29 Längs dessa linjer, är det viktigt att notera att färsk rapport från vår laboratorier var inte den första att tillämpa IEDDA kemi till pretargeting: den första rapporten från pretargeted avbildning med IEDDA uppstod från arbetet av Rossin, et al och innehöll en SPECT metodik som använder en ¹¹¹ In-märkta tetrazin ^30..

Som vi diskuterat ovan har pretargeting metodik fyra ganska enkla steg (Figur 2). I protokollet till hands, kommer en pretargeted strategi för PET avbildning av kolorektal cancer som sysselsätter ett ⁶⁴ Cu-NOTA-märkta tetrazin radioligand och TCO-modifierad konjugat av huA33 kroppen beskrivas. Dock är en av dess gr slutligen modularitet denna metodikäter av tillgångar, såsom trans -cyclooctene delen kan fogas till varje icke-internaliserande antikropp, och tetrazin kan fästas på en mängd olika radioaktiva reportrar.

Protocol

ETIK UTTALANDE: Alla de in vivo djurförsök beskrivna utfördes enligt ett godkänt protokoll och under de etiska riktlinjerna i Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). 1. Syntes av Tz-Bn-NOTA I ett litet reaktionskärl, lös 7 mg NH 2 -Bn-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) i 600 | il NaHCOs 3 buffert (0,1 M, pH 8,1). Kontrollera lösningens pH. Om det behövs, justera pH…

Representative Results

De inledande tre steg av experimentet – syntes av Tz-Bn-NOTA, konjugering av TCO till huA33, och den radiomärkning av Tz-Bn-NOTA konstruera (figurerna 3 och 4) – är mycket tillförlitliga. I fallet med förfarandet ovan, var Tz-Bn-NOTA konstruktion syntetiseras i högt utbyte och renhet. Den huA33 kroppen modifierades med 4,2 ± 0,6 TCO / mAb och Tz-Bn-NOTA radiomärktes med 64 Cu för att ge den renade radioligand i> 99% radiokemisk renhet,> 85% förfall korrigerat a…

Discussion

Den huvudsakliga fördelen med denna pretargeted PET imaging strategi är att den kan avgränsa tumörer med mål-till-bakgrundsbild kontrast på bara en bråkdel av bakgrunds stråldos som produceras av direkt märkta antikroppar. Till exempel i den kolorektal cancer avbildningssystemet beskrivs här, var data från akut biodistribution experiment används för att utföra dosimetri beräkningar för ⁶⁴ Cu-baserade pretargeting strategi tillsammans med direkt-märkt ⁶⁴ Cu-NOTA-huA33 och ^89</s…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C