Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.
Dendroecological forskning bruger information lagret i træringe at forstå, hvordan enlige træer og endda hele skovøkosystemer reageret på miljøforandringer og endelig rekonstruere sådanne ændringer. Dette gøres ved at analysere vækst variationer tilbage i tiden og korrelere forskellige anlægsspecifikke parametre (for eksempel) temperatur optegnelser. Integration træ anatomiske parametre i disse analyser vil styrke rekonstruktioner, selv ned til intra-årlige opløsning. Vi har derfor forelægge en protokol om, hvordan man prøve, forberede og analysere træ eksemplar til almindelige makroskopiske analyser, men også for efterfølgende mikroskopiske analyser. Derudover introducerer vi en potentiel løsning til analyse af digitale billeder genereret fra almindelige små og store prøver at støtte tidsserier analyser. Protokollen viser de grundlæggende trin, som de kan på nuværende tidspunkt anvendes. Ud over dette er der et fortsat behov for forbedring af eksisterende teknikker, og udvikling af nye techniques, at registrere og kvantificere tidligere og igangværende miljømæssige processer. Traditionelle træ anatomiske forskning skal udvides til at omfatte økologiske oplysninger for dette forskningsfelt. Dette vil støtte Dendro-forskere, der har til hensigt at analysere nye parametre og udvikle nye metoder til at forstå de kort- og langsigtede effekter af specifikke miljømæssige faktorer på anatomi træagtige planter.
Træer, samt buske, dværgbuske og endda urter, viser mangfoldige reaktionsmønstre i forbindelse med ændringer i deres miljø. Disse mønstre har været genstand for botanik og plantefysiologi siden midten af det 19. århundrede. Dengang forskning i træagtige planter fokuserede mest på træer og en beskrivende analyse af strukturen og variabilitet af årringe i en økologisk sammenhæng 1. Da Andrew Ellicott Douglass opfandt cross-dating teknik til træ-ring forskning 2, var dette økologiske sammenhæng mere eller mindre undertrykt af den nye evne til præcist datere træ fund i arkæologi. Cross-dating for første gang gjorde det muligt for præcis datering af træringe til kalenderåret, og er indtil nu som rygraden i træ-ring forskning inden for alle områder af sit program 1.
Sideløbende hermed siden slutningen af det 19. århundrede, træ anatomi udviklet sig til en vigtig forskning disciplin vedrørerd til mange andre områder af naturlige og anvendte videnskaber 3. To vigtige domæner indføres: systematisk træ anatomi, som er grundlaget for at identificere træ i arkæologi 4, og den anvendte træ anatomi, relateret til træ teknologi, fysiologi, patologi, og økologi 3,5.
I træ-ring forskning, i dag dendroecology defineres som et emne, der omfatter træ-ring relaterede undersøgelser, der fokuserer på miljøundersøgelser såsom geomorfiske processer (dendrogeomorphology), temperatur og nedbør rekonstruktioner (dendroclimatology), ændringer vandstand (dendrohydrology) eller endog gletscher svingninger ( dendroglaciology) 6. Da denne definition indikerer, har træ-ring analyser blevet stadig vigtigere inden for dating og rekonstruere miljømæssige processer, som (i) fortidens klima ved at analysere de årlige variationer i ring bredde 7,8, træ tæthed 9 eller isotoper 10, eller (ii) than tilbagefald mellemrum geomorfiske processer 11. Disse meget detaljerede undersøgelser om ring-bredde variationer og deres isotopiske indhold påvise behovet for at analysere ringe nærmere, dvs at studere anatomiske struktur af ringene. Men er detaljerede studier af træ anatomiske træk inden årringene relateret til miljøændringer sjælden 12,13. Selv om disse mikroskopiske træk kendes 14, har de sjældent blevet anvendt på et mikroskopisk niveau dendroecological forskning. Desuden præcis timing af disse reaktioner vækst i naturligt dyrkede træer, der er afgørende for nøjagtige dating formål, er sjældent blevet dokumenteret for nylig 15.
Hvad angår virkningerne af den globale opvarmning 16, til en forbedring af eksisterende og udvikling af nye teknikker registrere og kvantificere tidligere og igangværende miljømæssige processer er påkrævet, især med hensyn til klimapåvirkning forskning 11.Ved at udvide den traditionelle træ anatomiske forskning til et økologisk baseret træ anatomi 17, kan Dendro-forskere analysere nye parametre og udvikle nye metoder til at forstå de kort- og langsigtede virkninger af specifikke miljømæssige faktorer på anatomi træagtige planter 18. Detaljeret viden om variationer i forskellige celleparametre inden for de enkelte ringe tilknytning til bestemte drivere (f.eks mekaniske kræfter, klimavariationer) er den grundlæggende forudsætning for at forstå variabiliteten i træet ring formation. Sammenlignet med almindelige ring bredde målinger, identificere træ anatomiske variationer kræver mere komplekse og ekspansiv forberedelse teknikker, der kræver en masse arbejde og tid. Detaljerede procedurer prøve skæring, farvning og forankring er mangfoldige og er altid afhængig af formålet med undersøgelsen 19.
For makroskopisk analyse af ring bredde i nåletræer eller strukturer til antal, størrelse eller distribution af skibe i hårdttræ er overfladen af en prøve normalt poleret med fint sandpapir eller specielle slibemaskiner 20. En ulempe ved denne procedure er opfyldningen af de enkelte celler med støv, der forhindrer yderligere halvautomatisk mikroskopisk analyse 21. De bedste resultater for makroskopisk prøveforberedelse opnås, når prøvens overflade er skåret ved hjælp af et barberblad eller en anden skarp kniv.
Mens for små prøver, barberblade er et perfekt værktøj; større prøver fyldning kræver opskæring af plane flader over hele omfanget af kerner. I modsætning til slibning, er cellerne ikke er fyldt med støv, som muliggør yderligere forberedelse til den efterfølgende billedanalyse. Endvidere åbne celler lumen, de korrekt skåret cellevægge, og den plane overflade af hele prøven muliggøre anvendelsen af højfrekvente densitometri 22 til hele omfanget af kernen. For billedet analyser, overfladen af prøver (cellevægge) kan farves under anvendelse af mørk farve og de åbne celle lumen kan efterfølgende fyldes med hvidt kridt for at forbedre kontrasten mellem cellevæggen og lumen området 19,23. Denne temmelig enkel teknik muliggør en grundlæggende makroskopisk vurdering af større cellestrukturer for fartøjets størrelse målinger.
Disse teknikker til at skære plane flader er tilstrækkelige til makroskopiske analyser. For en detaljeret træ anatomiske (dvs. mikroskopisk) analyse, transmitteret lysmikroskopi er den mest almindelige metode, der anvendes i Dendro videnskaber. Xylem celler differentierer gennem komplekse processer omfatter celletype bestemmelse, celledeling, celledifferentiering og programmeret celledød 24. Da timingen og hastigheden, hvormed disse processer opstår bestemme celle anatomiske egenskaber, kan de miljømæssige forhold, der påvirker disse processer genererer anatomiske afvigelser i ringen struktur. Som en vigtig forudsætning for disse analyseres, skal være forberedt med en microtome 19 mikro sektioner. Ved udarbejdelsen prøver til sektionering, synligheden af tracheider eller fiber retning er afgørende. Det anbefales at bruge af hånd drevet glidende mikrotomer at skære mikro sektioner, fordi denne teknik letter høj kvalitet sektioner efter behov for billedet analyser 19. Afhængigt af det specifikke formål med en bestemt undersøgelse, er mikro sektioner skåret vinkelret på eller parallelt med den langsgående udstrækning af cellerne. Disse afsnit er derefter fotograferet under et mikroskop og celle dimensioner målt ved hjælp af specialiseret billede analyserer software.
Indtil for nylig var i stand til at forberede mikro sektioner begrænset til små prøver kun (ca. 1 cm x 1 cm). Det er acceptabelt at analysere enkeltstående begivenheder som forstyrrelser i bestemte år, men denne teknik tillader ikke den udvidede tidsserieanalyse nødvendig for miljømæssige rekonstruktioner. Denne indsats kan kun realisered gennem udvikling af nye, effektive og økonomiske forberedelsesprocedurer og analyseteknikker. I de senere år har medlemmerne af træ-ring laboratorium på det schweiziske føderale Research Institute WSL i Schweiz begyndte intensivt arbejde med dette emne. Som følge heraf har nye enheder og analysere teknikker blevet udviklet til at støtte tanken om at integrere træ anatomiske træk til en bred vifte af miljømæssige forskningsemner.
Udfordringerne for en vellykket og bæredygtig integration af træ anatomi i dendroecological forskning er, bortset fra mangfoldige analytiske problemer, hovedsagelig på grund af tekniske aspekter. Disse udfordringer spænder fra princippet prøveudtagning tilgange til at skabe høj kvalitet mikro sektioner og deres efterfølgende analyse 19.
Ved første øjekast, prøvetagning af kerner eller endda diske er en simpel procedure, der har været kendt i mange år nu. Der er mange ting, der kan gøres forkert og en lille unøjagtighed i prøvetagning kan resultere i alvorlige problemer under den videre udformning og analyse faser. Små unøjagtigheder som udkerning der er ikke ligefrem vinkelret på stamceller akse eller ved hjælp af en ufuldkomment skærpet corer er ikke et problem, hvis formålet med undersøgelsen er begrænset til at ringe bredde målinger. Men når der sigtes til mikroskopisk analyse af prøverne, kan en forkert retning prøvetagning medføre optiske fordrejninger afcellevægge, mens anvendelsen af stumpe corers resulterer i mikrorevner i kernen. Som et resultat, når de forsøger at skære mikro sektioner af disse kerner, de tynde sektioner blot falde fra hinanden og en effektiv forberedelse ikke længere garanteret. Det samme gælder for mikro-core stikprøver. Vil en stump spids resultere i højt tryk, når stanseorganet hamres ind i stammen træ. Derfor cambial lag vil blive komprimeret. De cambial celler (figur 5) er derfor klemt og kan ikke analyseres.
Disc prøveudtagning er faktisk den bedste strategi, når man analyserer vækst variationer at relatere dem til miljøændringer. Desværre er det simpelthen umuligt at tage diske fra alle træer, der er bestemt til at blive udtaget til yderligere analyser. Alligevel, især i tilfælde af tropisk dendrokronologi, er en vis mængde af stamceller diske behov i kombination med tilvækst kerner. Skiverne bruges som en base for at definere ring grænser og for at dette kan understøtte boundarerne defineret på grundlag af en analyse tilvækst kerner 12,27,28.
Fordele og ulemper ved slibning versus opskæring ofte diskuteret 1,11,21. Som det er nævnt ovenfor, den bedste fremgangsmåde afhænger altid af forskningsspørgsmålet og de parametre, der skal analyseres (makroskopisk eller mikroskopisk). Hvis isotopiske eller kemiske analyser er forventet i en yderligere bearbejdning trin, er det af største betydning, at slibestøv skabt ved slibning, som kan fylde i celle lumina over hele prøven, fjernes omhyggeligt ved støvsugning eller trykluft.
Skæring mikro sektioner er for alle mikroskopisk analyserer den mest hensigtsmæssige måde at forberede prøver til yderligere analyser. Først og fremmest er sektionen afbrød prøven, som derefter kan holdes uden kontaminering for potentielle yderligere analyser. Second disse afsnit mulighed for høje målinger af encellede parametre opløsning. Desuden undgår tidskrævende indlejringteknik ved hjælp af en majsstivelse opløsning 26 at stabilisere cellerne er en stor fordel i mikro sektionering.
En ulempe ved mikro sektionering er stadig den begrænsede stikprøvestørrelse resulterer i lange tilberedningstider. For serie realtid analyser gå tilbage i tiden gennem århundreder eller endda årtusinder, er der behov for at videreudvikle eksisterende skærende enheder 17,19, men også billedbehandling og analyse 18. Et første skridt i denne retning er udviklingen af kernen mikrotom 21, oprindelig fremstillet til at skære plane flader på kerner (figur 1). Nylige undersøgelser viste evnen til at klippe mikro sektioner af hele kerner ved hjælp af denne enhed (figur 1).
Høj kvalitet mikro afsnit indeholder det grundlæggende princip for en effektiv billedanalyse. Under billederne under et mikroskop er en almindelig procedure 19, men deres effektive analyse er stadig en opgave, der skalskal udvikles yderligere 17. Alle eksisterende billedanalyse systemer er semi-automatisk, dvs de har brug for at være mere eller mindre intenst kontrolleret af tekniker. I mange tilfælde har brug for de billeder, der skal rettes eller endda nye billeder skal gøres for at forbedre kontrasten for en bedre registrering af de strukturer af softwaren uden at ændre celle vægtykkelse i billedet.
Specialized billede analyseværktøjer såsom Roxas 18 WinCell eller særlige scripts til ImageJ 29 er i stand til at levere basale anatomiske data såsom celle nummer, celle dimension, cellevæg tykkelse og celle position under den årlige ring. Mange ekstra anatomiske målinger, der er relevante i en dendroecological sammenhæng kan beregnes ud fra disse grundlæggende målinger såsom størrelse af de største ledninger, størrelsesfordeling af ledninger, størrelse earlywood eller den første række af ledninger, (optisk) træ tæthed, intra-årlige profiler af ledningen størrelse og cellevægtykkelse, og gruppering mønstre af ledninger (ensom, multipla, etc.).
Brug af softwaren Roxas 18, er konturerne af ledningen lumina (dvs. vand ledende celle) og årlige ring grænser automatisk anerkendes og visuelt repræsenteret som overlejringer over originalbilledet. Algoritmer Detection for ledninger er baseret på farve, størrelse og information form, afsløring algoritmer til ring grænser op til den lokale forhold i hver enkelt ledning. En værktøjskasse giver os mulighed for manuelt at forbedre disse resultater ved direkte redigering af overlay-funktioner, dvs., slette, tilføje og ændre ring grænser og ledning skitserer. Efter redigering det endelige data output, herunder celle vægtykkelse (nåletræer), genereres automatisk og gemmes i et regneark. Fuldautomatiske systemer er i øjeblikket ikke tilgængelig, ikke engang for nåletræer, der viser en forholdsvis enkel struktur, men det er et mål for den fremtidige udvikling. Dette vil kraftigt støtte full integration af træ anatomiske parametre tidsserier analyser.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.
Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |