Metoder til evaluering cytotoksicitet og Immunosuppression af brændbare tobaksvare Forberedelser
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Blandt andre patofysiologiske ændringer, kronisk eksponering for cigaretrøg forårsager betændelse og immunsuppression, som er forbundet med øget modtagelighed af rygere til mikrobielle infektioner og tumorforekomst. Ex vivo undertrykkelse af receptor-medierede immunresponser i humane perifere blod-mononukleære celler (PBMC'er) behandlet med røg bestanddele er en attraktiv metode til at studere mekanismerne og vurdere de sandsynlige langsigtede virkninger af eksponering for tobaksvarer. Her har vi optimeret metoder til at udføre ex vivo-assays under anvendelse af PBMC'er stimuleret med bakterielt lipopolysaccharid, en Toll-lignende receptor-4-ligand. Virkningerne af hele røg-medium (WS-CM), blev et præparat brændbart tobaksvare (TPP), og nikotin undersøgt på cytokinudskillelse og target celledrab af PBMC'er i ex vivo assays. Vi viser, at secernerede cytokiner IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 og IL-8 og intracellulære cytokiner IFN47 ;, TNF-α og MIP-1α blev undertrykt i WS-CM-eksponerede PBMC'er. Den cytolytiske funktion af effektorceller PBMC'er, som bestemt ved en K562 target celledræbende assay blev også reduceret ved udsættelse for WS-CM; nikotin var minimalt effektive i disse assays. Sammenfattende præsenterer vi en række forbedrede analyser for at evaluere effekten af TPPS i ex vivo assays og disse metoder kan let tilpasses til testning af andre produkter af interesse.
Introduction
En betydelig mængde viden peger på de sundhedsskadelige virkninger af kronisk cigaretrygning, herunder hjerte-kar-sygdom (CVD), kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) og kræft 1,2. Kronisk cigaretrygning har været kendt for at forårsage inflammation og immunsuppression, og disse ændringer er rapporteret at bidrage til øget risiko for mikrobiel infektion og cancer hos rygere 3. In vitro og ex vivo teknikker er anvendelige belyse den molekylære basis for de patofysiologiske virkninger af cigaretrøg 4-9 (tabel 1) og er anerkendt som vigtige værktøjer til at lede den nye regulering af forskellige tobaksvarer 10,11.
For eksempel har vi vist, at brændbare tobaksvarer præparater (TPPS) såsom hel røg-medium (WS-CM) og total partikler (TPM) er langt mere cytotoksiske og skadeligt forDNA end ikke-brændbare TPPS eller nikotin 12,13. I overensstemmelse med det offentliggjorte arbejde, blev det for nylig rapporteret, at brændbart TPPS eller nikotin 12,13. I overensstemmelse med det offentliggjorte arbejde, for nylig rapporteret vi at brændbare TPPS forårsagede markant immunosuppression. Dette blev vist ved suppression af Customs lignende receptor (TLR) -ligands, stimuleret cytokinsekretion og målrettet celle (K562) aflivning af PBMC'er i en ex vivo model 14. I betragtning af betydningen af betændelse i cigaretrøg-induceret sygdom processer, er yderligere optimering af assaybetingelserne at evaluere de immunmodulerende virkninger af cigaretrøg præsenteres i denne rapport.
Ex vivo assays måles typisk intracellulære og secernerede cytokiner samt cytolytiske funktion af cytotoksiske T-og NK-celler i K562 celledrabsassays 14. Assayene involveret præinkubation med WS-CM og nikotin og efterfølgende stimulering af PBMCs med TLR agonister over en periode på 3 dage; de endelige aflæsning udføres ved hjælp af enzym-linked immunosorbent assays (ELISA) og / eller flowcytometri. Vi udnyttede bakterielt lipopolysaccharid (LPS), som binder til TLR-4-receptorer og stimulerer PBMC'er resulterer i produktion af intracellulære cytokiner og sekretion af cytokiner. Ud over at optimere de forskellige analysetrin for evaluering af de immunmodulerende virkninger af TPPS vi også nuværende metoder til isolering af PBMC'er, celledødsassays og IL-8 kvantificering. Disse metoder kan anvendes til at løse andre forskningsspørgsmål og yderligere raffineres for at vurdere tobaksvarer i lovgivningen.
Tabel 1. Udgivet rapporter om in vitro og ex vivo-metoder anvendt til at undersøge varilus patofysiologiske virkninger af tobaksvarer præparater CS, cigaretrøg medium.; CSC, cigaretrøg kondensat; CSE, cigaretrøg ekstrakt; ELISA, enzymkoblet immunosorbent assay; GADPH, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase; qPCR, kvantitativ polymerase kædereaktion; RT, real time kvantitativ polymerase kædereaktion; TS, tobaksrøg.
| Forfatter (Studieår) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Celler | Humane bronkiale endothelceller (BEAS-2B), humane neutrofiler | Humane alveolære epitelceller (A549) | Humane luftvejenes glatte muskelceller (HASMC) | Humane premonocytic U937-celler, humane monocytter | Alveolær type II epitelceller (ATII) | Menneskelig monocytiskcellelinie (THP-1), human lungemakrofager |
| TPP anvendt | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Anvendt metode | ELISA, qPCR, migration, eltrafik skift | Immunohistokemisk-kemi, elektroforese Arrayscan kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforese | Gel-mobilitet skift | Lysmikroskopi elektronmikroskopi, elektroforese ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate kit (Sigma), p65 pladeassay (Transam), elektroforese forskellige immunoassay kits |
| Mål | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, migration | Histonacetyltransferaser, histondeacetylaser, NF-KB, IL-8, pI KB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxin | Varmechok / stressproteiner (HSP / Hsp70), HF transskriptionsfaktor NF-KB,TNF-α | Surfactant protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK phosphorylering, cJun: DNA-binding, glutathion, p65: DNA-binding |
| Slutresultat | CSE nedregulerer cytokinproduktion via undertrykkelse af AP-1-aktivering. | H 2 O 2 og CSC øge acetylering af histon proteiner, mindske histondeacetylaseaktivitet, differentielt regulerer proinflammatoriske cytokin frigørelse. | Cigaretrøg kan forårsage frigivelse af IL-8 fra HASMC, forstærket af TNF-α, 20% CSE mindre IL-8 release inhibering af eotaxin og RANTES af cigaretrøg. | TS aktiveret HF transskriptionsfaktor, som var forbundet med Hsp70 overekspression og inhibering af NFkB bindende aktivitet og TNF-α release. | Reduceret ATII celleafledte kemokinniveauer kompromis ALVEOLAR reparation, bidrage til cigaretrøg-induceret alveolær skade og emfysem. | Data giver mekanistisk forklaring på, hvorfor rygere er steget luftvejsinfektioner. Undertrykkelse af den medfødte reaktion ledsages af en stigning i IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi og andre har tidligere demonstreret, at behandling af PBMC'er med TPPS undertrykker flere reaktioner, herunder ekspression og sekretion af cytokiner og funktionelle foranstaltninger såsom målcelle dræbe 14. De eksperimentelle metoder beskrevet i det tidligere arbejde kræver længere inkubationsperioder og var beskedne i størrelse 14. I betragtning af de potentielle anvendelser af denne attraktive ex vivo model for grundlæggende og anvendt forskning, undersøgte vi, om nogen af…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er finansieret af RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) under en samarbejdsaftale forskning med Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad er en fuld tid medarbejder i RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
