Methoden om Evalueer Cytotoxiciteit en Immuunsuppressie van brandbare Rookwaren Voorbereidingen
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Onder andere pathofysiologische veranderingen, chronische blootstelling aan sigarettenrook veroorzaakt ontsteking en immuunonderdrukking, die zijn gekoppeld aan verhoogde gevoeligheid van rokers om microbiële infecties en tumoren. Ex vivo onderdrukking van receptor gemedieerde immuunresponsen in humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) behandeld met rookbestanddelen is een aantrekkelijke benadering van mechanismen bestuderen en de mogelijke lange termijn effecten van blootstelling aan tabaksproducten te evalueren. Hier hebben we optimale werkwijzen ex vivo assays met PBMC gestimuleerd door bacterieel lipopolysaccharide, een Toll-like receptor-ligand 4 uitvoeren. De effecten van de hele rook-geconditioneerd medium (WS-CM), een voorbereiding brandbare tabaksproduct (TPP), en nicotine werden onderzocht op cytokine secretie en doelcel doden door PBMCs in de ex vivo testen. We zien dat uitgescheiden cytokines IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 en IL-8 en intracellulaire cytokinen IFN47 ;, TNF-α en MIP-1α werden onderdrukt WS-CM-blootgestelde PBMC. De cytolytische functie van effector PBMCs, zoals bepaald met een K562 doelwitcel doden assay werd ook verminderd door blootstelling aan WS-CM; nicotine was minimaal effectief in deze assays. Samengevat presenteren we een reeks verbeterde tests om de effecten van TPPs in ex vivo assays te evalueren en deze werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast voor het testen van andere interessante producten.
Introduction
Een aanzienlijke hoeveelheid kennis wijst op de nadelige gevolgen voor de gezondheid van chronische roken van sigaretten, waaronder hart- en vaatziekten (HVZ), chronische obstructieve longziekte (COPD) en kanker 1,2. Chronische roken van sigaretten is bekend ontsteking en immuunsuppressie veroorzaken, en deze wijzigingen worden gerapporteerd bijdragen aan een verhoogd risico op microbiële infecties en kanker bij rokers 3. In vitro en ex vivo technieken bruikbaar in het ophelderen van de moleculaire basis van de pathofysiologische effecten van sigarettenrook 4-9 (tabel 1) en worden erkend als belangrijke instrumenten voor de geleiding van de opkomende regulering van verschillende tabaksproducten 10,11.
Zo hebben we aangetoond dat brandbare tabaksproduct preparaten (TPPs) zoals hele rook geconditioneerd medium (WS-CM) en totale deeltjes (TPM) zijn veel cytotoxische en schadelijkDNA dan niet-brandbare TPPs of nicotine 12,13. Consistent met de gepubliceerde werk, werd onlangs gemeld dat brandbare TPPs of nicotine 12,13. Consistent met de gepubliceerde werk, hebben we onlangs gemeld dat brandbare TPPs veroorzaakt gemarkeerde immunosuppressie. Dit werd bewezen door onderdrukking van Toll- like receptor (TLR) -ligands, gestimuleerd cytokine secretie, en gerichte cel (K562) doden door PBMCs in een ex vivo model 14. Gezien het belang van een ontsteking in sigarettenrook geïnduceerde ziekte processen, wordt een verdere optimalisatie van de testomstandigheden aan het immuunsysteem modulerende effecten van sigarettenrook te evalueren die in dit rapport.
De ex vivo assays meestal gemeten intracellulaire en uitgescheiden cytokinen alsook de cytolytische functie van cytotoxische T- en NK-cellen in K562 celdodingassays 14. De assays betrokken voorincubatie met WS-CM en nicotine en daaropvolgende stimulatie van PBMCs TLR-agonisten gedurende 3 dagen; de laatste uitlezingen worden uitgevoerd middels enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) en / of flowcytometrie. We gebruik bacterieel lipopolysaccharide (LPS), dat bindt aan TLR-4-receptoren en stimuleert PBMC resulterend in de productie van intracellulaire cytokinen en uitscheiding van cytokinen. Naast optimalisatie van de verschillende assaystappen voor evaluatie van de immunomodulerende effecten van TPPs presenteren we ook werkwijzen voor het isoleren PBMC, celdood assays en IL-8 kwantificering. Deze methoden kunnen worden toegepast op andere onderzoeksvragen te pakken en verder verfijnd om tabaksproducten te evalueren in het regelgevend kader.
Tabel 1. Gepubliceerde rapporten van in vitro en ex vivo methoden gebruikt om varilus pathofysiologische effecten van tabaksproducten voorbereidingen studeren CS, sigarettenrook medium.; CSC, sigarettenrook condensaat; CSE, sigarettenrook extract; ELISA, enzymgekoppelde immunosorbent assay; GADPH, glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase; qPCR, kwantitatieve polymerase kettingreactie; RT, real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie; TS, tabaksrook.
| Auteur (Jaar van de studie) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Cellen gebruikt | Menselijke bronchiale endotheel cellen (BEAS-2B), humane neutrofielen | Human alveolaire epitheelcellen (A549) | Human luchtweg gladde spiercellen (HASMC) | Menselijke premonocytische U937-cellen, humane monocyten | Alveolaire type II epitheelcellen (ATII) | Human monocytairecellijn (THP-1), menselijke long macrofagen |
| TPP gebruikt | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Gebruikte methode | ELISA, qPCR, migratie, elektromobiliteit shift | Immunohistochemische-chemie, elektroforese, Arrayscan kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforese | Gel-mobility shift | Lichtmicroscopie, elektronenmicroscopie, elektroforese, ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate kit (Sigma), p65 plaat assay (TransAM), elektroforese, verschillende immunoassay kits |
| Maatregel | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, migratie | Histon acetyltransferasen, histondeacetylasen, NF-KB, IL-8, pI KB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxine | Heat shock / stress-eiwitten (HSP / Hsp70), HF transcriptiefactor, NF-KB,TNF-α | Oppervlakteactieve eiwitten (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK fosforylatie cJun: DNA binding, glutathion, p65: DNA binding |
| Eindresultaat | CSE down-reguleert cytokine productie via onderdrukking van AP-1 activering. | H 2 O 2 en CSC verbeteren acetylering van histon-eiwitten, histondeacetylaseac activiteit te verminderen, differentieel reguleren pro-inflammatoire cytokine release. | Sigarettenrook kan de afgifte van IL-8 uit HASMC, versterkt door TNF-α, 20% CSE minder IL-8 release, Remming van eotaxine en RANTES door sigarettenrook veroorzaken. | TS HF geactiveerde transcriptiefactor, die werd geassocieerd met Hsp70 overexpressie en remming van NFkB bindingsactiviteit en TNF-α afgifte. | Verminderde ATII cel afkomstige chemokine niveaus compromis AlveoLAR reparatie, wat bijdraagt aan sigarettenrook geïnduceerde alveolaire schade en emfyseem. | Gegevens te verstrekken mechanistische verklaring voor waarom rokers zijn toegenomen infecties van de luchtwegen. Onderdrukking van de aangeboren respons gepaard gaat met een toename van IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat de behandeling van PBMCs met TPPs onderdrukt verschillende reacties, waaronder expressie en secretie van cytokines en functionele maatregelen zoals doelcel doden 14. De experimentele methoden in de vorige werk beschreven, vereisen een langere incubatietijd en waren bescheiden in omvang 14. Gezien de mogelijke toepassingen van dit aantrekkelijke ex vivo model voor fundamenteel en toegepast onderzoek, hebben we onderzocht of een van de test paramet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gefinancierd door RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) in het kader van een gezamenlijk onderzoek overeenkomst met de Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad is een full-time medewerker van RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
