À l’aide d’essais ex vivo optimisés sur cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC), nous avons montré qu’une préparation de produit du tabac combustible supprime de manière marquée les cytokines sécrétées par voie intracellulaire médiées par les récepteurs et la capacité cytolytique des PBMC effecteurs. Ces tests rapides peuvent être utiles pour évaluer les produits et comprendre les effets potentiels à long terme de l’exposition au tabac.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l'immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac
Dans cet article
Résumé
Résumé
Parmi les autres modifications physiopathologiques, l'exposition chronique à la fumée de cigarette provoque une inflammation et une suppression immunitaire, qui ont été liés à une sensibilité accrue des fumeurs à des infections microbiennes et l'incidence des tumeurs. Ex vivo suppression des réponses immunitaires médiés par les récepteurs dans les cellules mononucléaires périphériques humaines du sang (PBMC) traité avec constituants de la fumée est une approche intéressante pour étudier les mécanismes et d'évaluer les effets probables à long terme de l'exposition aux produits du tabac. Ici, nous avons optimisé méthodes pour effectuer des dosages ex vivo en utilisant des PBMC stimulés par un lipopolysaccharide bactérien, un récepteur de ligand-4 de type Toll. Les effets de milieu de la fumée conditionné ensemble (WS-CM), une préparation de produits du tabac combustible (TPP), et la nicotine ont été étudiés sur la sécrétion de cytokines et de destruction des cellules cible par les PBMC dans les tests ex vivo. Nous montrons que des cytokines sécrétées IFN-γ, le TNF, l'IL-10, IL-6 et IL-8 et des cytokines intracellulaires IFN47 ;, TNF-α, MIP-1α et ont été supprimées dans les CMSP WS-CM-exposées. La fonction cytolytique des PBMC effectrices, telle que déterminée par un dosage de cellules cibles K562 tuant a également été réduite par exposition à WS-CM; la nicotine est très peu efficace dans ces essais. En résumé, nous présentons un ensemble de tests améliorés pour évaluer les effets du PPT en essais ex vivo, et ces méthodes pourraient être facilement adaptés pour tester d'autres produits d'intérêt.
Introduction
Un ensemble considérable de points de connaissances sur les effets néfastes sur la santé du tabagisme chronique, notamment les maladies cardiovasculaires (MCV), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) et le cancer 1,2. Chronique tabagisme a été connu pour causer l'inflammation et l'immunosuppression, et ces modifications sont signalés à contribuer à un risque accru d'infection microbienne et le cancer chez les fumeurs 3. In vitro et ex vivo techniques sont utiles pour élucider la base moléculaire des effets physiopathologiques de la fumée de cigarette 4-9 (tableau 1) et sont re....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
NOTE: le consentement éclairé de faire cette étude a été obtenue à une unité clinique locale de recherche sous approbation de l'IRB, par les bonnes pratiques cliniques. Traitement du sang, l'isolement des PBMC et d'autres expériences de culture cellulaire sont effectuées dans des conditions stériles, l'utilisation de consommables et réactifs microbiologiquement stérile.
1. Préparation WS-CM
- Générer WS-CM comme décrit précédemment 12.
- Préparer WS-CM en passant la fumée de quatre 3R4F cigarettes de référence grâce à Roswell Park Institute Memorial (RPMI) 1640 milieu sans rouge de phénol, avec u....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (quatre échantillons de donneurs). T-test de Student entre les échantillons de contrôle traités et non traités a été réalisée en utilisant le logiciel Excel ainsi que des comparaisons t-test pour tous les traitements avec leurs contrôles correspondants. La signification statistique est indiquée par: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.
Pour mesurer l'effet de l'exposition à WS-CM et la.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Nous et d'autres avons précédemment démontré que le traitement des PBMC avec PPT inhibe plusieurs réponses, y compris l'expression et la sécrétion de cytokines et les mesures fonctionnelles telles que la cellule cible 14 tuant. Les méthodes expérimentales décrites dans l'ouvrage précédent nécessitent des périodes d'incubation plus longues et ont été modestes en amplitude 14. Étant donné les applications potentielles de cette jolie modèle ex vivo pour la recherche fondamenta.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.
Remerciements
Ce travail est financé par RJ Reynolds Tobacco Company (de RJRT) en vertu d'un accord de collaboration de recherche avec l'École de médecine Wake Forest University. GL Prasad est un employé à temps plein de la RJRT.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 12 tubes de 75 mm | BD Falcon | 352058 | |
| tubes coniques de 15 ml | Corning | 430790 | |
| Microtubes de 2 ml | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F cigarettes de référence | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| Tubes coniques de 50 ml | Corning | 430828 | |
| flacon | de 500 mlCorning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| Plaque à fond plat à 96 puits | Termo Nunc | 439454 | |
| Plaques à fond rond à 96 puits | BD Falcon 353077 | ||
| Hotte de culture cellulaire | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifugeuse Eppendorf | 58110R | ||
| CFSE | Sondes moléculaires Life Technologies | C34554 | |
| Tubes en grappe | Corning | 4401 | Nocif en cas d’ingestion, cancérigène |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Inflammable |
| DMSO (diméthylsulfoxyde) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Le logiciel analyse les données CBA |
| Unité de filtrage | Nalgene | 156-4020 | |
| Cytomètre en flux | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 couleurs, à Ex 405 et Em 785. |
| Cytomètre en flux | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 couleurs à Ex 495 et Em 785. |
| Logiciel d’analyse par cytométrie en flux | Tree Star | FlowJo | |
| Conteneur de congélation | Nalgene | 5100-0001 | Contient du DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Cancérogène, irritant, corrosif |
| H2SO<>4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Kit | de cytokines inflammatoires humainesBD Biosciences | 551811 | |
| IFN-&gamma ; V-500 Anticorps | BD Horizon | 561980 | Sensibilisant cutané |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Tampon d’isolement | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Liquide inflammable, irritant |
| Alcool isopropylique | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-&alpha ; PE Anticorps | BD Pharmingen | 554730 | Toxicité aiguë, orale |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Toxicité aiguë, danger pour l’environnement |
| Parafilm | Bemis | " M" | |
| Paraformaldéhyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Inflammable, irritation cutanée |
| Pen/streptocoque | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Tampon de | fonctionnement MACS Tampon de fonctionnement, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-&alpha ; Alexa Fluor 488 Anticorps | BioLegend | 502915 | |
| Pipette de transfert | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Références
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogu....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
Explorer plus d’articles
