Summary

Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l'immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac

Published: January 10, 2015
doi:

Summary

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

Abstract

Parmi les autres modifications physiopathologiques, l'exposition chronique à la fumée de cigarette provoque une inflammation et une suppression immunitaire, qui ont été liés à une sensibilité accrue des fumeurs à des infections microbiennes et l'incidence des tumeurs. Ex vivo suppression des réponses immunitaires médiés par les récepteurs dans les cellules mononucléaires périphériques humaines du sang (PBMC) traité avec constituants de la fumée est une approche intéressante pour étudier les mécanismes et d'évaluer les effets probables à long terme de l'exposition aux produits du tabac. Ici, nous avons optimisé méthodes pour effectuer des dosages ex vivo en utilisant des PBMC stimulés par un lipopolysaccharide bactérien, un récepteur de ligand-4 de type Toll. Les effets de milieu de la fumée conditionné ensemble (WS-CM), une préparation de produits du tabac combustible (TPP), et la nicotine ont été étudiés sur la sécrétion de cytokines et de destruction des cellules cible par les PBMC dans les tests ex vivo. Nous montrons que des cytokines sécrétées IFN-γ, le TNF, l'IL-10, IL-6 et IL-8 et des cytokines intracellulaires IFN47 ;, TNF-α, MIP-1α et ont été supprimées dans les CMSP WS-CM-exposées. La fonction cytolytique des PBMC effectrices, telle que déterminée par un dosage de cellules cibles K562 tuant a également été réduite par exposition à WS-CM; la nicotine est très peu efficace dans ces essais. En résumé, nous présentons un ensemble de tests améliorés pour évaluer les effets du PPT en essais ex vivo, et ces méthodes pourraient être facilement adaptés pour tester d'autres produits d'intérêt.

Introduction

Un ensemble considérable de points de connaissances sur les effets néfastes sur la santé du tabagisme chronique, notamment les maladies cardiovasculaires (MCV), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) et le cancer 1,2. Chronique tabagisme a été connu pour causer l'inflammation et l'immunosuppression, et ces modifications sont signalés à contribuer à un risque accru d'infection microbienne et le cancer chez les fumeurs 3. In vitro et ex vivo techniques sont utiles pour élucider la base moléculaire des effets physiopathologiques de la fumée de cigarette 4-9 (tableau 1) et sont reconnus comme des outils importants pour guider la réglementation émergent de différents produits du tabac 10,11.

Par exemple, nous avons démontré que les préparatifs combustibles de produits du tabac (PPT) comme milieu complet de fumée conditionné (WS-CM) et la matière particulaire totale (TPM) sont beaucoup plus cytotoxique et dommageable pourADN que PPT non combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l'ouvrage publié, il a été récemment rapporté que PPT combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l'ouvrage publié, nous avons récemment signalé que PPT combustibles causés immunosuppression marquée. Ceci a été démontré par la suppression de Toll Like Receptor (TLR) -ligands, stimulé la sécrétion de cytokines, et la cellule ciblée (K562) tuer par les PBMC dans un modèle ex vivo 14. Étant donné l'importance de l'inflammation dans les processus de la maladie induite fumée cigarettes, poursuite de l'optimisation des conditions d'essai pour évaluer les effets immunomodulateurs de la fumée de cigarette est présenté dans ce rapport.

Les essais ex vivo typiquement mesurés et intracellulaire des cytokines ainsi que la fonction cytolytique de cellules NK et T cytotoxiques dans la cellule K562 tuant des dosages 14 sécrétées. Les dosages impliqués pré-incubation avec WS-CM et la nicotine et la stimulation ultérieure de PBMCs avec agonistes de TLR pendant une période de 3 jours; les lectures finales sont effectuées en utilisant des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) et / ou la cytométrie de flux. Nous avons utilisé le lipopolysaccharide bactérien (LPS), qui se lie à des récepteurs TLR-4 stimule les PBMC et conduisant à la production de cytokines intracellulaires et la sécrétion de cytokines. En plus de l'optimisation des différentes étapes essai pour l'évaluation des effets immunomodulateurs de PPT, nous avons également présents procédés pour isoler les PBMC, des dosages de mort cellulaire et de l'IL-8 quantification. Ces méthodes peuvent être appliquées pour aborder d'autres questions de recherche et affinés pour évaluer les produits du tabac dans le contexte réglementaire.

Tableau 1. Publié rapports de in vitro et ex vivo méthodes utilisées pour étudier les effets physiopathologiques Varilux de préparations de produits du tabac CS, le milieu de la fumée de cigarette. SCC, la fumée de cigarette condensat; CST, cigarette extrait de fumée; ELISA, enzyme dosage immunoenzymatique; GADPH, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase; qPCR, réaction quantitative en chaîne par polymérase; RT en temps réel réaction en chaîne par polymérase quantitative; TS, la fumée de tabac.

Auteur (Année de l'étude) Laan et al. (2004) Moodie et al. (2004) Oltmanns et al. (2005) Vayssier (1998) Witherden et al. (2004) Birrell et al. (2008)
Les cellules utilisées Cellules bronchiques humaines de l'endothélium (BEAS-2B), les neutrophiles humains Cellules épithéliales alvéolaires humaines (A549) Les cellules musculaires lisses des voies respiratoires humaines (HASMC) Cellules U937 prémonocytique humaines, des monocytes humains Alvéolaires de type II cellules épithéliales (ATII) Monocytaire humainelignée cellulaire (THP-1), les macrophages pulmonaires humaines
TPP utilisé CST SCC CST TS CST CS
Méthode utilisée ELISA, qPCR, la migration, l'électromobilité changement Immuno-chimie, électrophorèse, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA ELISA, RT-PCR, PCR quantitative, l'électrophorèse Gel-décalage de mobilité La microscopie optique, la microscopie électronique, l'électrophorèse, ELISA qPCR, ELISA, kit E-TOXATE (Sigma), plaque de p65 dosage (TransAM), électrophorèse, diverses trousses d'immunoessais
Mesure IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migration histones acétyltransférases, les histones désacétylases, NF-kB, IL-8, pI-kB α, GADPH HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, l'éotaxine Heat Shock / protéines de stress (HSP / Hsp70), HF facteur de transcription NF-kB,TNF-α Protéine tensioactif (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, le TNF-α, IL-1β, l'IFN-γ IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, α-MIP1, GRO-α, MAPK / JNK / phosphorylation de ERK, cJun: liaison à l'ADN, le glutathion, p65: liaison à l'ADN
Résultat final CST régule à la baisse la production de cytokines par la suppression de l'AP-1 activation. H 2 O 2 et SCC améliorer acétylation des histones, diminuer l'activité histone déacétylase, différentielle régulent la libération de cytokines pro-inflammatoires. La fumée de cigarette peut causer la libération d'IL-8 de HASMC, renforcée par le TNF-α, 20% moins CST IL-8 libération, inhibition de l'éotaxine et RANTES par la fumée de cigarette. TS HF activés facteur de transcription qui a été associée à la surexpression de la Hsp70 et l'inhibition de l'activité NFkB et de TNF-α libération de liaison. Réduction ATII niveaux de chimiokines dérivées de cellules compromis alveolar réparation, contribuant à la cigarette induit fumée lésions alvéolaires et l'emphysème. Données fournissent explication mécaniste pour les infections respiratoires pourquoi les fumeurs ont augmenté. Suppression de la réponse innée se accompagne d'une augmentation de l'IL-8.

Protocol

NOTE: le consentement éclairé de faire cette étude a été obtenue à une unité clinique locale de recherche sous approbation de l'IRB, par les bonnes pratiques cliniques. Traitement du sang, l'isolement des PBMC et d'autres expériences de culture cellulaire sont effectuées dans des conditions stériles, l'utilisation de consommables et réactifs microbiologiquement stérile. 1. Préparation WS-CM Générer WS-CM comme décrit précédemment 12. <o…

Representative Results

Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (quatre échantillons de donneurs). T-test de Student entre les échantillons de contrôle traités et non traités a été réalisée en utilisant le logiciel Excel ainsi que des comparaisons t-test pour tous les traitements avec leurs contrôles correspondants. La signification statistique est indiquée par: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005. Pour mesurer l'effet de l'exposit…

Discussion

Nous et d'autres avons précédemment démontré que le traitement des PBMC avec PPT inhibe plusieurs réponses, y compris l'expression et la sécrétion de cytokines et les mesures fonctionnelles telles que la cellule cible 14 tuant. Les méthodes expérimentales décrites dans l'ouvrage précédent nécessitent des périodes d'incubation plus longues et ont été modestes en amplitude 14. Étant donné les applications potentielles de cette jolie modèle ex vivo pour la r…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est financé par RJ Reynolds Tobacco Company (de RJRT) en vertu d'un accord de collaboration de recherche avec l'École de médecine Wake Forest University. GL Prasad est un employé à temps plein de la RJRT.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
12 X 75 tubes BD Falcon 352058
15 ml conical tubes Corning 430790
2 mL Microtubes Axygen MCT-150-C-S
3R4F reference cigarettes   Univ. of Kentucky, College of Agriculture 3R4F
50 ml conical tubes Corning 430828
500 ml bottle Corning 430282
7AAD BD Pharmingen 559925
96 well flat bottom plate Termo Nunc 439454
96 well round bottom plates BD Falcon 353077
Cell culture hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Centrifuge Eppendorf 58110R
CFSE Molecular Probes Life Technologies C34554
Cluster tubes Corning 4401 Harmful if swallowed, carcinogen
Cytofix/Cytoperm (Permwash) BD Biosciences 555028 Flammable
DMSO (Dimethyl sulfoxide ) Sigma-Aldrich D8418
DPBS Lonza 17-512F
FBS Sigma-Aldrich F2442
FCAP Array BD Biosciences 652099 Software analyzes CBA data
Filter unit Nalgene 156-4020
Flow Cytometer BD Biosciences FACS Canto II  8 colors, at Ex 405 and Em785.
Flow Cytometer BD Biosciences FACS Calibur  4 colors at Ex 495 and Em 785.
Flow cytometry analysis software Tree Star FlowJo
Freezing Container Nalgene 5100-0001 Contains DMSO,  irritant
GogliPlug BD Biosciences 555029 Carcinogen, Irritant, Corrosive 
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741
Human Inflammatory Cytokine Kit BD Biosciences 551811
IFN-γ V-500 Antibody BD Horizon 561980  skin sensitizer
IL-8 ELISA Kit R and D Systems DY208
Isolation Buffer Isolymph, CTL Scientific Corp. 1114868 Flammable liquid, Irritant 
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907
L-Glutamine Gibco Life Technologies 25030-081
LPS Sigma-Aldrich L2630
MIP1-α PE Antibody BD Pharmingen 554730 Acute toxicity, Oral
Monensin Sigma-Aldrich M5273
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Nicotine Sigma-Aldrich N3876 Acute toxicity, Environmental hazard
Parafilm Bemis “M”
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Flammable, Skin irritation 
Pen/strep Gibco Life Technologies 15140-122
RPMI 1640 Gibco Life Technologies 11875-093
Running buffer MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech 130-091-221
Th1/Th2 CBA Kit BD Biosciences 551809
TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody BioLegend 502915
Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-20
Tris Base Sigma-Aldrich T1503

References

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Citer Cet Article
Arimilli, S., Damratoski, B. E., G.L., P. Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations. J. Vis. Exp. (95), e52351, doi:10.3791/52351 (2015).

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