Metodi per valutare citotossicità e immunosoppressione di combustibile di tabacco preparati prodotti
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Tra le altre modifiche fisiopatologiche, l'esposizione cronica al fumo di sigaretta provoca l'infiammazione e la soppressione immunitaria, che sono stati collegati a una maggiore suscettibilità dei fumatori a infezioni microbiche e di tumori. Ex vivo soppressione delle risposte immunitarie recettoriali nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) trattato con componenti del fumo è un approccio interessante per studiare i meccanismi e valutare i probabili effetti a lungo termine dell'esposizione ai prodotti del tabacco. Qui, abbiamo ottimizzato metodi per eseguire test ex vivo utilizzando PBMC stimolate da lipopolisaccaride batterico, una Toll-like receptor-4 ligando. Gli effetti di tutto a medio-fumo condizionata (WS-CM), una preparazione prodotto del tabacco combustibili (TPP), e la nicotina sono stati esaminati sulla secrezione di citochine e obiettivo l'uccisione delle cellule dai PBMC nelle ex vivo saggi. Abbiamo dimostrato che le citochine secrete IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 e citochine intracellulari IFN-47 ;, TNF-α, e MIP-1α sono stati soppressi in PBMC WS-CM-esposte. La funzione citolitica di PBMC effettrici, come determinato da un saggio di cellula bersaglio K562 uccidere è stato ridotto da esposizione a WS-CM; nicotina era minimamente efficace in questi test. In sintesi, vi presentiamo una serie di migliori test per valutare gli effetti delle centrali termiche nel ex vivo saggi, e questi metodi potrebbero essere facilmente adattato per testare gli altri prodotti di interesse.
Introduction
Un numero consistente di punti di conoscenza per gli effetti negativi per la salute del fumo di sigaretta cronica, tra cui malattie cardiovascolari (CVD), broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e il cancro 1,2. Il fumo di sigaretta cronica è stato conosciuto per causare infiammazione e la soppressione immunitaria, e queste alterazioni sono segnalati per contribuire ad un aumento del rischio di infezioni microbiche e cancro nei fumatori 3. In vitro e ex vivo le tecniche sono utili a chiarire le basi molecolari degli effetti fisiopatologici di fumo di sigaretta 4-9 (Tabella 1) e sono riconosciuti come importanti strumenti per guidare la regolamentazione emergente di vari prodotti del tabacco 10,11.
Ad esempio, abbiamo dimostrato che sostanze infiammabili prodotti del tabacco (centrali termiche) come complesso medio-fumo condizionata (WS-CM) e particolato totale (TPM) sono di gran lunga più citotossici e dannoso perDNA di centrali termiche non combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, è stato recentemente riportato che le centrali termiche combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, abbiamo recentemente riportato che centrali termiche combustibili causato marcata immunosoppressione. Ciò è stato dimostrato dalla soppressione del numero verde come recettore (TLR) -ligands, stimolata la secrezione di citochine, e mirata delle cellule (K562) l'uccisione da PBMC in un modello ex vivo 14. Data l'importanza di infiammazione in processi di malattia fumo-indotta sigaretta, un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di analisi per valutare gli effetti modulatori immunitari del fumo di sigaretta è presentata in questo rapporto.
Gli ex vivo saggi tipicamente misurate intracellulare e citochine, nonché la funzione citolitica di T citotossici e le cellule NK nella cella K562 uccidendo 14 saggi secreti. I saggi coinvolti pre-incubazione con WS-CM e nicotina e successiva stimolazione di PBMCs con TLR agonisti per un periodo di 3 giorni; le letture finali sono eseguite utilizzando saggi immunoenzimatica (ELISA) e / o di citometria a flusso. Abbiamo utilizzato lipopolisaccaride batterico (LPS), che si lega a recettori TLR-4 e stimola PBMC conseguente produzione di citochine intracellulari e secrezione di citochine. Oltre all'ottimizzazione dei vari passaggi del test per valutare gli effetti immunomodulatori di centrali termiche, abbiamo anche i metodi attuali per PBMCs isolamento, saggi di morte cellulare, e IL-8 quantificazione. Questi metodi possono essere applicati per affrontare altre questioni di ricerca e ulteriormente raffinato per valutare i prodotti del tabacco nel contesto normativo.
Tabella 1. Pubblicato segnalazioni di in vitro e ex vivo i metodi utilizzati per studiare varilus effetti fisiopatologici di preparati prodotti tabacco CS, media fumo di sigaretta.; CSC, fumo di sigaretta condensa; CSE, estratto di fumo di sigaretta; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi; qPCR, reazione a catena della polimerasi quantitativa; RT, in tempo reale reazione a catena della polimerasi quantitativa; TS, fumo di tabacco.
| Autore (Anno di corso) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Le cellule utilizzate | Le cellule umane bronchiali endoteliali (BEAS-2B), neutrofili umani | Cellule epiteliali alveolari umani (A549) | Vie aeree liscio cellule muscolari umane (HASMC) | U937 premonocytic umane, monociti umani | Tipo alveolare II cellule epiteliali (ATII) | Monocitica umanalinea cellulare (THP-1), macrofagi polmonari umane |
| TPP usato | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Metodo utilizzato | ELISA, qPCR, immigrazione, spostamento elettromobilità | Immunoistochimica-chimica, elettroforesi, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elettroforesi | Spostamento Gel-mobility | La microscopia ottica, microscopia elettronica, elettroforesi, ELISA | qPCR, ELISA, kit E-toxate (Sigma), piastra di p65 dosaggio (Transam), elettroforesi, vari kit immunodosaggio |
| Misura | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migrazione | Acetiltransferasi istoni, istone deacetilasi, NF-kB, IL-8, pI kB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotassina | Calore scossa / di stress proteine (HSP / Hsp70), HF fattore di trascrizione NF-kB,TNF-α | Tensioattivo proteina (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, α-TNF, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK fosforilazione, cJun: legame al DNA, il glutatione, p65: legame al DNA |
| Risultato finale | CSE down-regola la produzione di citochine mediante la soppressione di AP-1 attivazione. | H 2 O 2 e CSC migliorare acetilazione delle proteine istoniche, diminuire l'attività dell'istone deacetilasi, differenziale regolano il rilascio di citochine proinfiammatorie. | Il fumo di sigaretta può causare il rilascio di IL-8 da HASMC, arricchito da TNF-α, il 20% CSE meno di IL-8 rilascio, inibizione di eotassina e RANTES dal fumo di sigaretta. | TS attivati fattore HF di trascrizione, che è stato associato con Hsp70 sovraespressione e l'inibizione di NFkB attività e di rilascio del TNF-α vincolante. | Ridotto ATII livelli chemochine derivati dalle cellule compromesso alveoriparazione lar, contribuendo al fumo di sigaretta indotto danno alveolare e l'enfisema. | I dati forniscono spiegazione meccanicistica del perché i fumatori sono aumentate le infezioni respiratorie. Soppressione della risposta innata è accompagnata da un aumento di IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Noi e altri abbiamo già dimostrato che il trattamento dei PBMC con centrali termiche sopprime diverse risposte, tra cui l'espressione e la secrezione di citochine e misure funzionali come cellula bersaglio uccidendo 14. I metodi sperimentali descritti nel precedente lavoro richiedono periodi di incubazione più lunghi e sono stati modesti in grandezza 14. Date le potenziali applicazioni di questa affascinante ex vivo modello di ricerca di base e applicata, abbiamo studiato se nessuno …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è finanziato da RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) nell'ambito di un accordo di ricerca in collaborazione con la Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad è un dipendente a tempo pieno di RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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