방법은 가연성 담배 제품 준비의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하기
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
다른 병리 생리 학적 변화 중, 담배 연기 만성 노출은 미생물 감염 및 종양 발생률 흡연자의 감수성 증가로 연결되었다 염증 및 면역 억제를 야기한다. 생체 내 인간 말초 혈 단핵 세포에서 수용체 – 매개 면역 반응의 억제 (한 PBMC) 연기 성분으로 처리하는 메커니즘을 연구 및 담배 제품에 대한 노출 가능성이있는 장기 효과를 평가하는 매력적인 방법이다. 여기서 우리는 박테리아 리포 폴리 사카 라이드, 수신자 같은 수용체 4 리간드에 의해 자극 된 PBMC를 사용하여 생체 분석을 수행하는 방법을 최적화. 전체 연기 된 배지 (WS-CM)의 효과는, 가연성 담배 제품 준비 (TPP), 니코틴은 생체 분석에 PBMC를하여 사이토 카인 분비와 표적 세포 사멸에 조사 하였다. 우리는 그 표시 분비 사이토킨 IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-8, 사이토 카인의 세포 내 IFN-47 ;, TNF-α 및 MIP-1α는 WS-CM-노출 PBMC를 억제했다. K562의 표적 세포 살해 분석으로 산출 된 PBMC의 효과기 세포 용해 기능은 또한 WS-CM에 노출 감소; 니코틴은 이러한 분석에 최소한의 효과적이었다. 요약하면, 우리는 생체 내 분석의 TPP를 효과를 평가하기 위해 개선 된 분석법의 세트를 제공하고,이 방법은 용이하게 다른 관심있는 제품을 테스트하도록 구성 될 수있다.
Introduction
심혈관 질환 (CVD), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 암 1,2- 포함한 만성 흡연의 건강에 미치는 악영향에 기술 점의 실질적인 몸체. 만성 흡연은 염증과 면역 억제를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 이러한 변화는 흡연자 3 미생물 감염과 암의 위험 증가에 기여할 것으로보고되고있다. 생체 외 및 생체 기술이 유용의 병태 생리 학적 효과의 분자 기초를 해명에 담배 연기 4-9 (표 1)과 각종 담배 제품 (10, 11)의 새로운 규정을 안내하기위한 중요한 도구로 인식된다.
예를 들어, 우리는 전체 연기 된 배지 (WS-CM) 및 총 입자상 물질 (TPM) 등의 가연성 담배 제품 준비 (TPP를)이 훨씬 더 독성과 손상에 있음을 증명하고있다불연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)보다 DNA. 게시 된 작업과 일치, 그것은 최근에 가연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)이보고되었다. 게시 된 작업과 일치, 우리는 최근 가연성 TPP를 표시 한 면역 억제의 원인이 보도했다. 이것은 수용체 (TLR) -ligands 같은 톨의 억제에 의해 입증 된, 생체 모델 (14)에 한 PBMC에 의해 살해 (K562) 사이토 카인 분비를 자극, 세포를 대상으로. 흡연 – 유도 된 질병 과정에서 염증의 중요성을 감안하면, 담배 연기의 면역 조절 성 효과를 평가하기위한 분석 조건의 추가적인 최적화는 본 조사된다.
생체 외 분석은 일반적으로 세포 내 사이토 카인을 측정뿐만 아니라 분석 죽이고 14 K562 세포 내에서 세포 독성 T 세포 및 NK 세포 용해 기능을 분비. 분석은 WS-CM 및 니코틴과 PBMC의 후속 자극과 사전 배양을 포함TLR와 S 3 일에 걸쳐 주작 동근; 최종 판독은 효소 면역 분석법 (ELISA를)를 사용하여 및 / 또는 유동 세포 계측법으로 수행된다. 우리는 TLR-4 수용체에 결합하고,이 한 PBMC 세포 내 사이토 카인 및 사이토 카인 분비의 자극의 결과로 생산 세균 지질 다당류 (LPS)를 이용했다. 단리 한 PBMC, 세포 사멸 분석, 및 IL-8을 정량 TPP를 우리 또한 본 방법의 면역 조절 효과를 평가하기위한 각종 분석 단계의 최적화 외에. 이러한 방법은 다른 연구 문제를 해결하기 위해 적용 및 추가 규제 맥락에서 담배 제품을 평가하기 위해 정제 할 수있다.
표 1. 체외의 보고서를 간행하고 생체 방법은 담배 제품의 준비 varilus 병태 생리 학적 효과를 연구하는 데 사용 CS, 담배 연기 매체.; CSC, 담배 연기 응축; CSE, 담배 연기 추출물; ELISA, 면역 분석을 효소는 링크; GADPH, 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소; qPCR을 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응; RT, 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응; TS, 담배 연기.
| 저자 (연구 년) | Laan의 등 알. (2004) | 무디 등 알. (2004) | Oltmanns 등 알. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden 등 알. (2004) | Birrell 등 알. (2008) |
| 세포는 사용 | 인간 기관지 내피 세포 (BEAS-2B), 인간 호중구 | 인간의 폐포 상피 세포 (A549) | 인간기도 평활근 세포 (HASMC) | premonocytic 인간 U937 세포, 인간 단핵 | 폐포 유형 II 상피 세포 (ATII) | 인간 단핵구세포주 (THP-1), 인간 폐 식세포 |
| TPP 사용 | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| 방법 사용 | ELISA, qPCR에, 마이그레이션, 전기차 이동 | Immunohisto – 화학, 전기, Arrayscan 키트, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR에, 전기 영동 | 젤 이동성 변화 | 광학 현미경, 전자 현미경, 전기, ELISA | qPCR에, ELISA, E-toxate 키트 (시그마), P65 플레이트 분석 (TransAM), 전기 영동, 다양한 면역 키트 |
| 측정 | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, 마이그레이션 | 히스톤 아세틸 트랜스퍼, 히스톤 아세틸 라제, NF-κB, IL-8, PI κB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, 에오 | 열 충격 / 스트레스 단백질 (HSP / 인 Hsp70), HF 전사 인자, NF-κB,TNF-α | 계면 활성제 단백질 (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK 인산화 cJUN : DNA 결합, 글루타티온, P65 : DNA 결합 |
| 최종 결과 | CSE는 AP-1 활성의 억제를 통해 사이토 카인 생성을 하향 조절한다. | H 2 O 2와 CSC는 차별적으로, 히스톤 탈 아세틸 화 효소의 활성을 감소, 히스톤 단백질의 아세틸 화를 강화 염증성 사이토 카인의 방출을 조절한다. | 담배 연기는 담배 연기에 의해 TNF-α, 20 % CSE 이하 IL-8 릴리스, 에오 탁신의 억제 및 RANTES에 의해 강화 HASMC에서 IL-8의 출시를 일으킬 수 있습니다. | TS는 인 Hsp70 과발현 및 활동과 TNF-α 자료를 결합 NFkB의 억제와 관련이 HF 전사 인자를 활성화. | 감소 ATII 세포 유래 케모카인 수준의 타협 alveoLAR 수리, 담배 연기에 의한 폐포 손상과 폐기종에 기여. | 데이터는 왜 흡연자가 증가 호흡기 감염에 대한 기계적인 설명을 제공합니다. 선천성 반응 억제는 IL-8의 증가를 수반한다. |
Protocol
Representative Results
Discussion
우리와 다른 사람은 이전에 TPP를 함께 한 PBMC의 치료는 표현과 사이토 카인 및 대상 셀 (14)을 죽이는 기능 측정의 분비 등 여러 반응을 억제하는 것이 증명하고있다. 이전의 연구에서 설명하는 실험 방법은 더 이상 배양 기간을 필요로 크기 14에서 겸손했다. 기본이 매력적인 생체 모델의 응용 가능성을 감안할 및 응용 연구, 우리는 이러한 여러 단계의 생물학적 분석에서 분…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 의학의 웨이크 포레스트 대학과 공동 연구 계약에 따라 RJ 레이놀즈 담배 회사 (RJRT)에 의해 자금을 지원한다. GL 프라 사드는 RJRT의 풀 타임 직원입니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
