Metoder för att utvärdera Cytotoxicitet och Immunsuppression av Brännbar Tobaksprodukt Förberedelser
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Bland annat patofysiologiska förändringar, kronisk exponering för cigarettrök orsakar inflammation och immunsuppression, vilket har kopplats till ökad mottaglighet för rökare till mikrobiella infektioner och tumörincidens. Ex vivo suppression av receptormedierade immunsvar hos humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) behandlas med rökbeståndsdelar är en attraktiv metod för att studera mekanismer och bedöma de troliga långsiktiga effekterna av exponering för tobaksprodukter. Här, vi optimerade metoder för att utföra ex vivo-analyser som använder PBMC stimuleras av bakteriell lipopolysackarid, ett Toll-like receptor-4-ligand. Effekterna av hela rök-medium (WS-CM), var en brännbar tobaksprodukt beredning (TPP), och nikotin undersökts på cytokinutsöndring och målcellen dödande av PBMC i ex vivo-analyser. Vi visar att utsöndrade cytokiner IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 och IL-8 och intracellulära cytokiner IFN47 ;, TNF-α, och MIP-1α undertrycktes i WS-CM-exponerade PBMC. Den cytolytiska funktion effektorceller PBMC, som bestäms av en K562 mål celldödande analysen också minskas genom exponering för WS-CM; nikotin var minimalt effektiva i dessa analyser. Sammanfattningsvis presenterar vi en rad förbättrade analyser för att utvärdera effekterna av TPPS i ex vivo-analyser, och dessa metoder kan lätt anpassas för att testa andra produkter av intresse.
Introduction
En avsevärd mängd kunskap punkter för att de negativa hälsoeffekterna av kronisk rökning, inklusive hjärt-kärlsjukdom (CVD), kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) och cancer 1,2. Kronisk cigarettrökning har varit känt för att orsaka inflammation och immunsuppression, och dessa förändringar rapporteras att bidra till ökad risk för mikrobiell infektion och cancer hos rökare 3. In vitro och ex vivo tekniker är användbara för att belysa den molekylära grunden för de patofysiologiska effekterna av cigarettrök 4-9 (tabell 1) och redovisas som viktiga verktyg för att styra den framväxande regleringen av olika tobaksprodukter 10,11.
Till exempel har vi visat att brännbara produkt tobak (varje ny) såsom helhet rök-medium (WS-CM) och total partiklar (TPM) är långt mer cytotoxiska och skadarDNA än icke brännbara TPPS eller nikotin 12,13. I överensstämmelse med den publicerade arbete var det rapporterade nyligen att brännbara TPPS eller nikotin 12,13. I överensstämmelse med den publicerade arbeten, nyligen rapporterade vi att brännbara TPPS orsakat markant immunsuppression. Detta framgick av undertryckande av Toll- som receptor (TLR) -ligands, stimulerad cytokinutsöndring och målinriktad cell (K562) dödande av PBMC i en ex vivo-modell 14. Med tanke på betydelsen av inflammation i cigarettrök-inducerad sjukdomsprocesser, ytterligare optimering av analysförhållanden för att utvärdera de immunmodulerande effekter av cigarettrök som presenteras i denna rapport.
Ex vivo-analyser typiskt uppmätt intracellulära och utsöndrade cytokiner liksom den cytolytiska funktion av cytotoxiska T- och NK-celler i K562 celldödande analyser 14. Analyserna inblandade förinkubation med WS-CM och nikotin och efterföljande stimulering av PBMCs med TLR agonister under en period av 3 dagar; de slutliga avläsningar utförs med användning av enzymlänkade immunsorbentanalyser (ELISA) och / eller flödescytometri. Vi utnyttjade bakteriell lipopolysackarid (LPS), som binder till TLR-4-receptorer och stimulerar PBMC resulterande i produktion av intracellulära cytokiner och utsöndring av cytokiner. Utöver optimering av de olika analysstegen för utvärdering av de immunmodulerande effekterna av varje ny redovisar vi också förfaranden för isolering av PBMC, celldödsanalyser och IL-8 kvantifiering. Dessa metoder kan tillämpas för att ta itu med andra forskningsfrågor och ytterligare förfinas för att utvärdera tobaksvaror i regelverket.
Tabell 1. Publicerad rapporter om in vitro och ex vivo-metoder som används för att studera varilus patofysiologiska effekterna av förberedelser produkt tobak CS, cigarettrök mediet. CSC, cigarettrök kondensat; CSE, cigarettrök extrakt; ELISA, enzymkopplad immunabsorberande analys; GADPH, glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas; qPCR, kvantitativ polymeras kedjereaktion; RT, realtid kvantitativ polymeraskedjereaktion; TS, tobaksrök.
| Författare (Läses år) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Celler som används | Mänskliga bronkial endotelceller (BEAS-2B), humana neutrofiler | Mänskliga alveolära epitelceller (A549) | Mänskliga luftvägarnas glatta muskelceller (HASMC) | Mänskliga premonocytic U937-celler, humana monocyter | Alveolär typ II epitelceller (ATII) | Humant monocytiskcellinje (THP-1), humana lungmakrofager |
| TPP används | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Använd metod | ELISA, qPCR, migration, elektromobilitet skift | Immunohisto-kemi, elektrofores, Arrayscan kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elektrofores | Gel-mobility shift | Ljusmikroskopi, elektronmikroskopi, elektrofores, ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate kit (Sigma), p65 plattanalys (TRANSAM), elektrofores, olika immunanalyssatser |
| Åtgärd | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, migrering | Histon acetyltransferaser, histondeacetylaser, NF-kB, IL-8, pI KB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxin | Värme chock / stressproteiner (HSP / Hsp70), HF transkriptionsfaktor, NF-kB,TNF-α | Tensidprotein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK-fosforylering, cJun: DNA-bindning, glutation, p65: DNA-bindning |
| Slutresultat | CSE nedreglerar cytokin produktion via undertryckande av AP-1-aktivering. | H2O 2 och CSC öka acetylering av histonproteiner, minskar histondeacetylasaktivitet, differentiellt reglera proinflammatoriska cytokiner release. | Cigarettrök kan orsaka utsläpp av IL-8 från HASMC, förstärks av TNF-α, 20% CSE mindre IL-8 release, Hämning av eotaxin och RANTES av cigarettrök. | TS aktiverad HF transkriptionsfaktor, som var förknippad med Hsp70 överuttryck och inhibering av NFkB-bindningsaktivitet och TNF-α frisättning. | Minskad ATII-cellerna kemokina nivåer kompromiss Alveolar reparation, bidrar till cigarettrök-inducerad alveolär skada och emfysem. | Data ger mekanistisk förklaring till varför rökare har ökat luftvägsinfektioner. Dämpning av den medfödda svar åtföljs av en ökning av IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi och andra har tidigare visat att behandling av PBMC med TPPS trycker flera svar, bland annat uttryck och utsöndring av cytokiner och funktionella åtgärder såsom målcellen dödade 14. De experimentella metoder som beskrivs i det tidigare arbetet kräver längre inkubationsperioder och var blygsam i storlek 14. Med tanke på de potentiella tillämpningar av denna attraktiva ex vivo modell för grundforskning och tillämpad forskning, undersökte vi om någon av de analysparametrar i …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete är finansierat av RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) under ett forskningssamarbete avtal med Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad är en heltidsanställd för RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
