Yöntem Yanıcı Tütün Ürün Müstahzarların Sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Diğer patofizyolojik değişiklikler arasında, sigara dumanı kronik bir maruziyetin, mikrobik enfeksiyonlar ve tümör insidansı içenlerin artan hassasiyet ile bağlantılı olan enflamasyon ve bağışıklık bastırılması neden olur. Ex vivo insan periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinde reseptör aracılı bağışıklık tepkilerinin bastırılması (PBMC) duman bileşenleri ile tedavi mekanizmaları incelemek ve tütün ürünlerine maruz muhtemel uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için cazip bir yaklaşımdır. Burada, bakteriyel lipopolisakarit, bir Toll benzeri reseptör 4 ligand ile uyarılmış PBMC ile eks vivo tahliller yapmak için yöntemler iyi duruma getirilmiştir. Bütün duman koşullu ortam (WS-CM) etkileri, yanıcı bir tütün ürünü preparatı (TPP) ve nikotin ex vivo deneylerde PBMC'ler tarafından sitokin salgılanması ve hedef hücre öldürme etkisi incelenmiştir. Bu göstermektedir ki, salgılanan sitokinler, IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 ve IL-8 ve hücre içi sitokin IFN-47 ;, TNF-α ve MIP-1α WS-CM-maruz kalan PBMC'de bastırıldı. bir K562 hedef hücre öldürme deneyi ile belirlendiği gibi efektör PBMC sitolitik fonksiyon aynı zamanda, WS-CM maruz bırakılarak indirgenmiştir; Nikotin, bu deneylerde minimal bir etkiye sahip olmuştur. Özet olarak, eks vivo deneylerde TPPs etkilerini değerlendirmek için geliştirilmiş deneylerde, bir dizi mevcut ve bu yöntemler, hali hazırda ilgi konusu olan diğer ürünlerin test edilmesi için adapte edilebilir.
Introduction
Kardiyovasküler hastalık (CVD), kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve kanser gibi kronik 1,2 sigara içiminin olumsuz sağlık etkileri için bilgi noktalarının önemli bir vücut. Kronik sigara içiminin inflamasyon ve immün baskılanması neden olduğu bilinmektedir ve bu değişiklikler sigara içenlerde 3 mikrobiyal enfeksiyon ve kanser riskine katkıda bildirilmektedir. In vitro ve ex vivo teknikleri yararlıdır patofizyolojik etkileri moleküler temelini aydınlatılmasında sigara dumanı 4-9 (Tablo 1) ve çeşitli tütün ürünleri 10,11 ortaya çıkan yönetmelik yönlendirmek için önemli araçlar olarak kabul edilmektedir.
Örneğin, biz böyle bütün duman klimalı ortamda (WS-CM) ve toplam partikül madde (TPM) gibi yanıcı tütün ürünü preparatları (TPPs) çok daha sitotoksik ve zarar için olduğunu göstermiştirYanıcı olmayan TPPs veya nikotin 12,13 den DNA. Yayınlanan çalışma ile tutarlı olarak, son zamanlarda yanıcı TPPs veya nikotin 12,13 olduğu bildirildi. Yayınlanan çalışma ile uyumlu olarak, son zamanlarda yanıcı TPPs belirgin immunosupresyonun neden olduğunu bildirdi. Bu reseptör (TLR) -ligands gibi Toll- bastırılması ile kanıtlanmıştır, ex vivo modelde 14 PBMC'ler tarafından öldürülmesi (K562) sitokin salınımını stimüle, ve hücre hedefli. Sigara dumanı kaynaklı hastalık süreçlerindeki enflamasyon önemi göz önüne alındığında, sigara dumanı, bağışıklık düzenleyici etkilerini değerlendirmek için test koşulları daha fazla optimizasyon Bu raporda sunulan edilir.
Ex vivo tahliller tipik olarak hücre içi ölçülmüş ve sitokinler gibi tahliller 14 öldürme k562 hücresinin sitotoksik T ve NK hücrelerinin sitolitik fonksiyon salgılanan. deneyler, WS-CM ve nikotin ile PBMC'nin sonraki stimülasyonu ile ön inkübasyon söz konusuTLR ile s, 3 günlük bir süre boyunca agonistleri; son okumalar enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) kullanılarak ve / ya da akış sitometrisi uygulanır. Bu TLR-4 reseptörlerine bağlanmakta ve PBMC'ler, hücre içi sitokin ve sitokinlerin sekresyonu üretimi ile sonuçlanan uyaran bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) kullandı. Izole PBMC'ler, hücre ölümü deneyleri ve IL-8 miktar tayini için TPPs, aynı zamanda, bu yöntem immünomodülatör etkisini değerlendirmek için çeşitli deney adımları optimizasyonuna ek olarak. Bu yöntemler, diğer araştırma soruları için uygulanan ve düzenleyici bağlamda, tütün ürünler için özel olarak rafine edilebilir.
Tablo 1. in vitro raporları Yayınlandı ve ex vivo yöntemler tütün ürünü hazırlıkları varilus patofizyolojik etkilerini incelemek için kullanılan CS, sigara dumanı ortamı.; CSC, sigara duman yoğunluk; CSE, sigara dumanı özü; ELISA immünosorbent deneyi enzim-bağlı; GADPH, gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz; QPCR, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; RT, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; TS, tütün dumanı.
| Yazar (Ders yılı) | Schouwburgplein ve ark. (2004) | Moodie ve ark. (2004) | Oltmanns ve ark. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden ve ark. (2004) | Birrell ve ark. (2008) |
| Hücreler kullanılan | İnsan bronş endotel hücreleri (BEAS-2B), insan nötrofil | İnsan alveolar epitel hücreleri (A549) | İnsan solunum yolu düz kas hücreleri (HASMC) | İnsan premonocytic U937 hücreleri, insan monositleri | Alveoler tip II epitel hücreleri (ATII) | İnsan monositikhücre hattı (THP-1), insan akciğer makrofajlar |
| DYP kullanılan | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Yöntem kullanılan | ELISA, QPCR, göç, Elektrodevingenlik kayması | Immunhisto kimya, elektroforez, Arrayscan seti, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforez | Jel-mobilite kayma | Işık mikroskobu, elektron mikroskobu, elektroforez, ELISA | QPCR ELISA, E-toxate kiti (Sigma), p65, plaka deneyi (TransAM), elektroforez, çeşitli bağışıklık kitleri |
| Tedbir | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, göç | Histon asetiltransferazlar histon deasetilazlar, NF-KB, IL-8, ul kB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaksin | Isı şok / stres proteinleri (HSP / Hsp70), HF transkripsiyon faktörü NF-KB,TNF-α | Yüzey Aktif protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α MAPK / JNK / ERK fosforilasyonu, cJun: DNA bağlama, glutatyon, p65: DNA bağlama |
| Sonuç | CSE AP-1 aktivasyonu bastırılması yoluyla sitokin üretimini aşağı-düzenler. | H 2 O 2 ve CSC farklı olarak, histon deasetilaz etkinliğini azaltmak, histon proteinlerin asetilasyonunu geliştirmek proinflamatuvar sitokin salınımını düzenler. | Sigara dumanı, sigara dumanı TNF-α,% 20 CSE daha az, IL-8 salıverilmeleri, eotaksin inhibisyonu ve RANTES tarafından geliştirilmiş HASMC IL-8 salıverilmesini neden olabilir. | TH Hsp70 ekspresyonu ve aktivitesi ve TNF-α serbest bağlanma NFkB'nin inhibe edilmesi ile ilişkili HF transkripsiyon faktörü, aktif. | Azaltılmış ATII hücresinden türetilmiş kemokin düzeyleri ile uygun düşmek Alveolar onarım, sigara dumanı kaynaklı alveol hasarı ve amfizem katkıda bulunmaktadır. | Veriler neden sigara arttı solunum yolu enfeksiyonları için mekanistik açıklama. Doğal tepkinin bastırılması, IL-8 bir artış eşlik etmektedir. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Ve biz daha önce TPPs PBMC'lerin tedavi ifadesi ve sitokinler ve hedef hücre 14 öldürme fonksiyonel önlemlerin salgısı dahil olmak üzere çeşitli yanıtları bastırdığını göstermiştir. Bir önceki çalışmada tarif deneysel yöntemler daha uzun kuluçka dönemleri gerektiren ve büyüklüğü 14 mütevazı idi. Temel için bu cazip ex vivo model potansiyel uygulamalarını göz önüne alındığında ve uygulamalı araştırma, bu çok aşamalı biyolojik deneylerde d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Tıp Wake Forest Üniversitesi ile ortak araştırma anlaşması kapsamında RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) tarafından finanse edilmektedir. GL Prasad RJRT tam zamanlı çalışanı.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
