तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में neuronal microcircuits के electrophysiological और morphological विशेषता बनती पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग
Summary
Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.
Abstract
एक साथ इंट्रासेल्युलर biocytin भरने के साथ तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में दो (या अधिक) synaptically युग्मित न्यूरॉन्स (बनती रिकॉर्डिंग) से पैच दबाना रिकॉर्डिंग के संयोजन उनकी संरचनात्मक और कार्यात्मक संपत्तियों की एक सहसंबद्ध विश्लेषण की अनुमति देता है। इस विधि के साथ यह उनकी आकृति विज्ञान और electrophysiological प्रतिक्रिया पैटर्न से दोनों पूर्व और postsynaptic न्यूरॉन्स की पहचान करने और चिह्नित करने के लिए संभव है। बनती रिकॉर्डिंग इन न्यूरॉन्स के बीच कनेक्टिविटी पैटर्न के रूप में अच्छी तरह से दोनों रासायनिक और बिजली synaptic प्रसारण के गुणों का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। यहाँ, हम न्यूरॉन आकृति विज्ञान की एक इष्टतम वसूली के साथ एक साथ विश्वसनीय बनती रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का एक कदम-दर-कदम विवरण देते हैं। हम रासायनिक अन्तर्ग्रथन या अंतराल जंक्शनों के माध्यम से जुड़ा न्यूरॉन्स के जोड़े मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में पहचान कर रहे हैं कि कैसे वर्णन करेंगे। हम न्यूरॉन्स dendrit के अपने 3 डी आकृति विज्ञान प्राप्त करने के लिए खंगाला कर रहे हैं कि कैसे की रूपरेखा तैयार करेंगेआईसी और axonal डोमेन और कैसे synaptic संपर्कों की पहचान की है और स्थानीय कर रहे हैं। हम भी विशेष रूप से मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के दौरान वृक्ष के समान और axonal truncations से जुड़े लोगों के लिए इन दृढ़ता से कनेक्टिविटी अनुमानों को प्रभावित है, क्योंकि बनती रिकॉर्डिंग तकनीक के निरंतर और सीमाओं पर चर्चा करेंगे। हालांकि, क्योंकि बनती रिकॉर्डिंग दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा की यह मस्तिष्क में पहचान न्यूरोनल microcircuits पर synaptic प्रसारण के विभिन्न पहलुओं निस्र्पक में एक महत्वपूर्ण उपकरण रहेगा।
Introduction
दो synaptically युग्मित न्यूरॉन्स के बीच neuronal microcircuits मस्तिष्क में बड़े पैमाने पर नेटवर्क के निर्माण खंड हैं और synaptic सूचना संसाधन के मौलिक इकाइयां हैं। ऐसे न्यूरोनल microcircuits के लक्षण वर्णन के लिए एक शर्त आकृति विज्ञान और पूर्व और postsynaptic साथी न्यूरॉन्स दोनों के कार्यात्मक संपत्तियों, synaptic कनेक्शन (एस) और इसकी संरचना और कार्यात्मक तंत्र के प्रकार का पता करने के लिए है। हालांकि, synaptic कनेक्शन के कई अध्ययनों में एक Microcircuit में न्यूरॉन्स की कम से कम एक अच्छी तरह से विशेषता नहीं है। इस बार synaptic कनेक्टिविटी के अध्ययन में इस्तेमाल अपेक्षाकृत unspecific उत्तेजना प्रोटोकॉल का परिणाम है। इसलिए, प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुण या तो सब पर या केवल एक नहीं बल्कि छोटे हद तक पहचान नहीं कर रहे हैं (यानी, मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति आदि)। मार्कर द्वारा intracellular धुंधला के साथ संयोजन में बनती रिकॉर्डिंगbiocytin, neurobiotin या फ्लोरोसेंट रंगों के रूप में uch छोटे न्यूरोनल microcircuits के अध्ययन के लिए बेहतर अनुकूल हैं। इस तकनीक को एक ही समय में एक आकृति विज्ञान पहचान अन्तर्ग्रथनी कनेक्शन के कई संरचनात्मक और कार्यात्मक मापदंडों की जांच करने की अनुमति देता है।
दो न्यूरॉन्स के बीच तथाकथित 'एकात्मक' monosynaptic कनेक्शन तीव्र टुकड़ा तैयारी का उपयोग करते हुए दोनों cortical और subcortical मस्तिष्क क्षेत्रों 10/01 में जांच की गई है। प्रारंभ में, तेज microelectrodes इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था; बाद में, पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक कम शोर स्तर और एक बेहतर अस्थायी समाधान के साथ synaptic संकेतों की रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए नियुक्त किया गया था।
एक महत्वपूर्ण तकनीकी अग्रिम अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत (आईआर-डीआईसी) प्रकाशिकी 11-14, काफी यह संभव टी बन गया है, ताकि मस्तिष्क टुकड़ा में न्यूरॉन्स की दृश्यता और पहचान में सुधार हुआ है कि एक सूक्ष्म तकनीक का उपयोग किया गया थाओ नेत्रहीन पहचान synaptic कनेक्शन 15-17 से रिकॉर्डिंग प्राप्त करते हैं। सामान्य में, बनती रिकॉर्डिंग तीव्र टुकड़ा तैयारी में किया जाता है; केवल बहुत कुछ प्रकाशनों विवो 18-20 में synaptically जुड़े न्यूरॉन्स से उपलब्ध रिपोर्टिंग रिकॉर्डिंग कर रहे हैं।
बनती रिकॉर्डिंग का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एक कार्यात्मक लक्षण वर्णन प्रकाश और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म स्तर दोनों पर एक रूपात्मक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है कि इस तथ्य है (उदाहरण के लिए देखते हैं।, 7,16,21)। Histochemical प्रसंस्करण के बाद, synaptically जुड़े न्यूरॉन जोड़ी के वृक्ष के समान और axonal आकृति विज्ञान का पता लगाया जाता है। बाद में, यह इन मापदंडों तो एक विशिष्ट synaptic कनेक्शन का एक उद्देश्य वर्गीकरण के लिए एक आधार प्रदान कर सकता है आदि जैसे लंबाई, स्थानिक घनत्व, अभिविन्यास, शाखाओं में बंटी पैटर्न के रूप में रूपात्मक सुविधाओं यों के लिए संभव है। इसके अलावा, न्यूरोनल connecti के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है सबसे अन्य तकनीकों के विपरीतvity, बनती रिकॉर्डिंग भी एकात्मक synaptic कनेक्शन के लिए synaptic संपर्कों की पहचान की अनुमति। यह प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 16,21-27 का एक संयोजन का उपयोग कर या वृक्ष के समान कांटा की कैल्शियम इमेजिंग 28,29 का उपयोग कर सीधे किया जा सकता है। हालांकि, बाद दृष्टिकोण के साथ ही उत्तेजक नहीं बल्कि निरोधात्मक कनेक्शन अध्ययन किया जा सकता है कि यह पोस्टअन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर चैनलों के माध्यम से कैल्शियम बाढ़ की आवश्यकता के रूप में।
एक परिभाषित न्यूरोनल Microcircuit बनती रिकॉर्डिंग पर synaptic प्रसारण का एक विस्तृत विश्लेषण के अलावा भी अन्तर्ग्रथनी plasticity के नियमों 30,31 के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं – या ऐसे acetylcholine की 32 और एडेनोसाइन के रूप में न्यूरोट्रांसमीटर द्वारा synaptic प्रसारण के मॉडुलन – एगोनिस्ट / प्रतिपक्षी आवेदन के साथ संयोजन में 33।
Protocol
Representative Results
Discussion
Synaptically युग्मित उत्तेजक और / या निरोधात्मक न्यूरॉन्स से बनती रिकॉर्डिंग न्यूरोनल microcircuits के अध्ययन के लिए एक बहुत बहुमुखी दृष्टिकोण हैं। इतना ही नहीं इस दृष्टिकोण एक न्यूरॉन प्रकार के बीच synaptic कनेक्टिविटी ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2-3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
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