Forberedelse vedhæftende celler for X-ray fluorescens Imaging af Chemical Fiksering

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

Røntgenfluorescens imaging giver mulighed for både identiteten og mængden af ​​elementer til stede i en prøve, der skal rumligt løst. Incident røntgenstråler, med et energi valgt til at være større end elektron bindingsenergi af det tungeste element af interesse, overvinde bindingsenergi af indre skalelektroner til kernen ^1. Dette skaber en "hul" i elektron skallen. Som højere energi elektroner falder ned i disse huller, er fluorescerende røntgenstråler der udsendes, hvis bølgelængde afhænger af den energi, adskillelse af disse orbitaler. Da energi afstanden mellem orbitaler er karakteristisk for et givet grundstof, X-ray fluorescensemission har også karakteristiske bølgelængder, afhængigt af elementet. Det er denne emission ved en karakteristisk bølgelængde, der tillader identifikation af de tilstedeværende grundstoffer. Kalibrering af fluorescensintensiteten tillader kvantificering af elementer til stede.

Røntgenfluorescens mikroskopety (XFM) er blevet stadig mere anvendt, dels som følge af udviklingen af ​​meget strålende røntgen synkrotron kilder, som dem på Spring-8 i Japan, Europa Radiation Synchrotronbestrålingscenter Facility (ESRF) i Frankrig, og Advanced Photon Source ( APS) i USA ^2. Disse kilder giver meget høj intensitet røntgenstråler. Samtidig forbedringer i X-ray optik, såsom zone plade teknologi tillod fokusering af disse bjælker til sub-micron pletter, omend temmelig ineffektivt ^3. Med meget høj intensitet bjælker, selv en relativt lille mængde lys, der kan være fokuseret er tilstrækkelig til at excitere de endogene metaller i celler, der producerer signal, der kan måles med i øjeblikket tilgængelig detektor teknologi. Således studere den kemiske biologi af metaller i cellen er et program specielt, der gør brug af mange af den seneste udvikling i denne teknik ^4-10.

Der er mange kritiske faktorer, der skal overvejes, mens appliggende XFM at undersøge elementært distribution og kvantificering af dyrkede pattedyrceller eller andre biologiske prøver. For det første skal den prøve, der skal holdes intakt, både strukturelt og med hensyn til dets elementære sammensætning, for målingen skal være meningsfuld. For det andet skal prøven også bevares på en måde, så det er hårdfør til skaden stråling, der kan være forårsaget af en fokuseret røntgenstråle. En måde, at en prøve kan opfylde begge disse kriterier på en gang skal fryses hurtigt ind i en glasagtig, amorf is ^11,12. Hurtig indfrysning opnås ofte gennem forskellige kryopræservering teknikker såsom springet frysning eller højt tryk frysning ^13-16. Det er almindeligt accepteret, at kryopræservering bevarer samlede cellulære arkitektur og kemiske sammensætninger i biologiske prøver så tæt på naturligt forekommende tilstand som muligt. Kemisk fiksering på den anden side, på grund af den langsomme og selektiv gennemtrængning af fikseringsmidler i celler og væv well som efterfølgende ændringer i membranpermeabilitet, kan tillade forskellige cellulære ioner især diffunderbare ioner, såsom Cl, Ca og K skal udvaskede, tabte eller flyttet, hvilket gør undersøgelse af disse elementer suboptimale ^17-19. Trods den klare fordel, cryo-fiksering i forhold til kemisk fiksering i almindelighed, for adhærente mammale celler især kryopræservering har forskellige begrænsninger ^20-23. Den mest oplagte er, at ikke alle forskningslaboratorium har nem adgang til kryokonservering instrumenter. De fleste nuværende højtryk frysere eller endda kaste frysere er dyre og ejes kun af en delmængde af kryo faciliteter, som kan være langt fra hvor cellerne inkuberes. Fordelen ved kryopræservering kan handles til ulempen ved at rejse stress placeret på cellerne. Medens kryopræservering er helt sikkert den mest stringente måde at bevare prøver til røntgen fluorescens analyse, det er bestemt ikke den mest tilgængelige for alle forskere under alle omstændigheder;det er heller ikke altid afgørende, – hvis metallerne af interesse tæt bundet til kan rettes makromolekyler, og den opløsning, som prøven skal afbildes, er større end den skade på ultra-mikrostruktur, der måtte opstå under tørring. Opmærksom på de forbehold ^24, kan kemisk fiksering og tørring være et passende valg.

Andre faktorer i en succesfuld røntgenfluorescens imaging eksperiment omfatter grundig analyse. Røntgenfluorescens billeddannelse er fundamentalt røntgenfluorescens emissionsspektroskopi kombineret med raster-scanning til at give rumlig opløsning. X-ray fluorescensemissionsspektrer indsamlede indeholde en kombination af overlappende emissionstoppe, baggrund og de elastiske og uelastisk spredning toppe af den indfaldende stråle. Software, der gør det muligt for de-foldning af disse bidrag, og montering af emissionen toppe, har været en afgørende udvikling på dette område ^25. Også udvikling og kommerciel distribution af tynd-film-standarder med kendt sammensætning, der anvendes til at kalibrere fluorescensintensitet i forhold til materiale mængde, har også været meget vigtigt.

Denne protokol giver en beskrivelse af fremstillingen af ​​klæbende celler ved kemisk fiksering og lufttørring. Et afgørende trin i denne proces er væksten af ​​celler på siliciumnitrid vinduer, som ofte ikke klæber godt, gør blid skylning i en bestemt måde nøglen til succes.

Protocol

1. Fremstilling af Instrumenter, substrater, Kultur Medier og fade Håndtering af siliciumnitrid (Si 3 N 4) vinduer. Åbne kapslen lidt ved at klemme den ene ende indeholder vinduet på en sådan måde, at ikke klemme vinduet selv, mens det roterer den anden ende af kapslen med den anden hånd. Tjek et par omvendt, at spids pincet under stereomikroskop sørge for der er ingen klæbende, huller eller bøjninger på spidsen. Ellers kan vinduerne være brudt af en pincet …

Representative Results

Evnen til røntgen fluorescens billeddannelse til at give oplysninger om biologiske prøver er betinget af disse prøver forberedes på en sådan måde, at de er robuste over for skader stråling på tidsplan for forsøget, og alligevel deres kemiske og strukturelle træk er godt bevares. I ser resultatet af en prøve, der er blevet fremstillet som beskrevet ovenfor og afbildet, er det muligt at se, at der er variation i de tilstedeværende grundstoffer – indikerer, at fiksering bevaret disse aspekter af cellen …

Discussion

X-ray fluorescens billeddannelse er nyttig i mange områder, herunder Geosciences, materialevidenskab og kemisk biologi ^26-34. Fremskridt i synkrotron røntgenstråler, og deres fokus, har givet meget høj intensitet bjælker. Fokuseret røntgenstråler tilstrækkelig til at excitere de endogene metaller i celler nu eksisterer, producerer signal, der kan måles med i øjeblikket tilgængelig silicium afdrift detektor teknologi. Og studere den kemiske biologi af metaller i cellen er et program specielt, der g?…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde