Förbereda Vidhäftande Cells för röntgen fluorescens avbildning av Chemical Fixering

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

Röntgenfluorescens avbildning möjliggör både identiteten och mängden av element som förekommer i ett prov som skall spatialt upplöst. Incident röntgenstrålar, av en energi vald att vara större än den elektronbindningsenergin för den tyngsta elementet av intresse, övervinna bindningsenergin av inre-skal elektroner till kärnan ^1. Detta skapar ett "hål" i elektronskal. Som högre energi elektroner faller ned in i dessa hål, är fluorescensröntgenstrålar som avges vars våglängd är beroende av energi separationen av dessa orbitaler. Eftersom energiavståndet hos orbitaler är karakteristisk för ett givet element, har fluorescensemission röntgen även karaktäristiska våglängder, beroende på elementet. Det är denna emission vid en karakteristisk våglängd som möjliggör identifiering av de ämnen som förekommer. Kalibrering av fluorescensintensiteten medger kvantifiering av de närvarande elementen.

Röntgenfluorescens microscopy (XFM) har blivit allt utnyttjad, delvis på grund av utvecklingen av mycket lysande röntgen synkrotronexperiment källor, såsom de på Spring-8 i Japan, Europeiska Radiation Synchrotron Facility (ESRF) i Frankrike, och Advanced Photon Source ( APS) i USA ^2. Dessa källor ger mycket hög intensitet röntgenstrålar. Samtidigt, förbättringar i röntgenoptik, såsom zonskiva teknik, tillät fokuseringen av dessa balkar till submikrona fläckar, om än ganska ineffektivt ^3. Med mycket högintensiva balkar, även en relativt liten mängd ljus som kan fokuseras är tillräcklig för att excitera de endogena metaller i celler, som producerar signal som kan mätas med den tillgängliga detektorteknologi. Således studera kemisk biologi av metaller i cellen är ett program särskilt som använder många av den senaste utvecklingen i denna teknik ^4-10.

Det finns många viktiga faktorer som måste beaktas när appenliggande XFM att undersöka den elementära distribution och kvantifiering av odlade däggdjursceller eller andra biologiska prover. För det första måste det prov som skall hållas intakt, både strukturellt och med avseende på dess elementarsammansättning, för för mätningen skall vara meningsfull. För det andra måste provet också bevaras på något sätt så att den är härdig för strålningen skador som kan orsakas av en fokuserad röntgenstråle. Ett sätt att ett prov kan möta båda dessa kriterier på en gång är att snabbt fryses in i en glaskroppen, amorf is ^11,12. Snabb frysning uppnås ofta genom olika frysförvaring tekniker såsom dopp frysning eller högtrycks frysning ^13-16. Det är allmänt accepterat att frysförvaring bevarar övergripande cellulär arkitektur och kemiska sammansättningar i biologiska prover så nära naturliga tillstånd som möjligt. Kemisk fixering, å andra sidan, på grund av den långsamma och selektiv penetrering av fixeringsmedel in i celler och vävnader som well som efterföljande förändringar i membranpermeabiliteten, kan tillåta olika cellulära joner speciellt diffunderbara joner såsom Cl, Ca och K ska lakas, försvunna eller flyttas, vilket gör utredning av dessa element suboptimala ^17-19. Trots den klara fördelen med Cryo-fixering över kemisk fixering i allmänhet, för vidhäftande däggdjursceller i synnerhet, har frysförvaring olika begränsningar ^20-23. Den mest uppenbara är att inte varje forskningslabb har enkel tillgång till frysförvaring instrument. De flesta av dagens högtrycks frysar eller ens kasta frysar är kostsamma och ägs endast av en delmängd av cryo anläggningar, vilket kan vara långt från där cellerna inkuberas. Fördelen med frysförvaring kan handlas för nackdelen med resor stressen placeras på cellerna. Medan frysförvaring är säkerligen den mest rigorösa sättet att bevara prover för röntgenfluorescensanalys, är det verkligen inte den mest tillgängliga för alla forskare under alla omständigheter;inte heller är det alltid viktigt – om metallerna av intresse är hårt bundna till fastställbara makromolekyler, och den upplösning som provet kommer att avbildas är större än skadan på ultramikrostruktur som kan uppstå under torkning. Mindful av förbehåll ^24, kan kemisk fixering och torkning vara ett lämpligt val.

Andra faktorer i en framgångsrik röntgenfluorescens avbildningsexperiment inkluderar ordentlig analys. Röntgenfluorescens avbildning är i grunden röntgenfluorescensemissionsspektroskopi kombinerat med raster-scanning för att tillhandahålla rumslig upplösning. Röntgen fluorescens emissionsspektra insamlade innehålla en kombination av överlappande emissionstoppar, bakgrund och de elastiska och oelastiska spridnings toppar av den infallande strålen. Programvara som möjliggör de-faltning av dessa bidrag, liksom installation av utsläppstoppar, har varit en viktig utveckling för området ^25. Också, utveckling och kommersiell distrade distributionen av tunnfilmsstandarder av känd sammansättning, som används för att kalibrera fluorescensintensiteten i förhållande till materialmängden, har också varit mycket viktigt.

Protokollet ger en beskrivning av beredningen av vidhäftande celler genom kemisk fixering och lufttorkning. Ett viktigt steg i denna process är tillväxten av cellerna på kiselnitrid fönstren, som ofta inte följer också, vilket gör skonsam sköljning på ett speciellt sätt nyckeln till framgång.

Protocol

1. Beredning av Instrument, Substrat, Kultur Media och Rätter Hantering av kiselnitrid (Si 3 N 4) fönster. Öppna kapseln något genom att klämma en ände innehållande fönstret på ett sådant sätt att inte pressa själva fönstret, under rotation den andra änden av kapseln med den andra handen. Kontrollera ett par back, till spetsig pincett enligt stereomikroskop se till att det inte finns några lim, luckor eller utbuktningar på spetsen. Annars kan fönstren …

Representative Results

Förmågan hos röntgenfluorescensavbildning att ge information om biologiska prover är knuten dessa prover förbereds på ett sådant sätt att de är robusta för strålskador på tidsskalan för experimentet, och ändå deras kemiska och strukturella egenskaper är väl bevaras. I visa resultatet av ett prov som har tagits fram enligt ovan och avbildas, är det möjligt att se att det finns variationer i elementen närvarande – vilket tyder på att fixering bevarat dessa aspekter av cellen (Figur 1).</strong…

Discussion

Röntgen fluorescens avbildning är användbar inom många områden, bland annat geovetenskap, materialvetenskap och kemisk biologi ^26-34. Framsteg inom synkrotron röntgen, och deras fokus, har producerat mycket högintensiva strålar. Fokuserad röntgen balkar tillräcklig för att excitera de endogena metaller i cellerna nu finns, producerar signal som kan mätas med tillgängliga kisel drift detektorteknologi. Och studera kemiska biologin av metaller i cellen är ett program särskilt som använder många…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde