Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

Рентгеновской визуализации флуоресценции позволяет как идентичности и количества элементов, присутствующих в образце, чтобы быть пространственным разрешением. Инцидент рентгеновские лучи, из энергии выбранной быть больше энергии связи электрона самого тяжелого элемента интересов, преодолеть энергию связи электронов внутренних оболочек к ядру ^1. Это создает "дыру" в электронной оболочке. Как выше электроны падают в эти отверстия, флуоресцентные рентгеновские лучи испускаются, длина волны которого зависит от разности энергий этих орбиталей. С энергетический интервал орбиталей характерна для данного элемента, X-Ray флуоресценции также имеет характерные длины волн, в зависимости от элемента. Именно это излучение на характерной длине волны, что позволяет идентифицировать элементов, присутствующих. Калибровка интенсивности флуоресценции позволяет количественно оценивать элементов, присутствующих.

Рентгено-флуоресцентный microscopу (XFM) стала шире используются, отчасти в связи с развитием очень ярких рентгеновских источников синхротронного, таких, как в весенне-8 в Японии, Европы радиационной синхротронного фонда (ESRF) во Франции, и Advanced Photon Source ( APS) в США ^2. Эти источники обеспечивают очень высокой интенсивности рентгеновских лучей. В то же время, улучшения в рентгеновской оптики, такие как зона пластины технологии, позволило фокусировки лучей в этих субмикронных пятен, хотя и довольно неэффективно ^3. С очень пучков высокой интенсивности, даже относительно небольшое количество света, который может быть сфокусирован достаточно, чтобы возбудить эндогенные металлов в клетках, создавая сигнал, который может быть измерен с доступной в настоящее время технологии детектора. Таким образом, изучая химической биологии металлов в клетке одно приложение, в частности, позволяет использовать многие из недавних разработок в этой технике ^4-10.

Есть много критических факторов, которые необходимо учитывать при приложениележа XFM исследовать распределение элементов и количественно культивируемых клеток млекопитающих или других биологических образцов. Во-первых, образец должен быть сохранены, как структурно, так и в отношении его химического состава, для того, чтобы измерения, чтобы иметь смысл. Во-вторых, образец также должны быть сохранены в некотором роде, так что он вынослив к повреждению излучения, которые могут быть вызваны с помощью сфокусированного пучка рентгеновских лучей. Один из способов, что образец может удовлетворить обоим этим критериям сразу будет быстро замораживают в стекловидное тело, аморфного льда ^11,12. Быстрое замораживание часто достигается с помощью различных методов криоконсервации, таких как падение замораживания или высокого давления замораживания ^13-16. Общепризнано, что криоконсервации сохраняет общую клеточную архитектуру и химические составы в биологических образцах как можно ближе к нативном состоянии, насколько это возможно. Химической фиксации, с другой стороны, из-за медленной и селективной проникновения фиксаторов в клетках и тканях, как шELL как последующие изменения в проницаемости мембран, может позволить различные клеточные ионы особенно к диффузии ионы, такие как Cl, Ca и K для выщелачивания, потерянных или перемещены, таким образом делая расследование этих элементов неоптимальных ^17-19. Несмотря на явное преимущество в крио-фиксации в течение химической фиксации в целом, для прикрепленных клеток млекопитающих, в частности, криоконсервация имеет различные ограничения ^20-23. Наиболее очевидным является то, что не каждый исследовательская лаборатория имеет легкий доступ к криоконсервации инструментов. Большинство современных морозильники высокого давления или даже погрузить морозильники являются дорогостоящими и принадлежит только подмножество крио объектов, которые могут быть далеко, где клетки инкубируют. Преимущество криоконсервации может быть обменены на недостаток хода стресса, размещенной на клетках. Таким образом, в то время как криоконсервация, безусловно, самый строгий способ сохранить образцы для анализа рентгеновской флуоресценции, это, конечно, не самый доступный для всех исследователей при всех обстоятельствах;и это не всегда необходимо – если металлы, представляющие интерес, тесно связан с фиксируемым макромолекул, и разрешение, с которым образец будет изображена больше, чем ущерб, к ультра-микроструктуры, которые могут возникнуть в процессе сушки. Памятуя о оговорками ^24, химической фиксации и сушки может быть подходящим выбором.

Другие факторы в успешном рентгеновского эксперимента флуоресцентной томографии включают надлежащий анализ. Флуоресценции формирования изображений рентгеновским излучением в корне рентгеновской спектроскопии флуоресценции в сочетании с растровым сканированием, чтобы обеспечить пространственное разрешение. Спектры флуоресценции рентгеновских собранные содержат комбинацию совпадающих вершин выбросов, фон, и упругие и неупругие пики рассеяния падающего луча. Программное обеспечение, которое позволяет де-свертку этих взносов, а также установку пиков выбросов, был критический развитие в этой области ^25. Кроме того, развитие и коммерческое расстояниеribution тонкопленочных стандартам известного состава, используемого для калибровки интенсивности флуоресценции по отношению к материальной количестве, также очень важно.

Этот протокол содержит описание приготовления адгезивных клеток с помощью химической фиксации и сушки на воздухе. Важным шагом в этом процессе является рост клеток на нитрида кремния окон, которые часто не придерживаются хорошо, что делает нежный промывания в определенном ключе моды к успеху.

Protocol

1. Подготовка инструментов, подложек, культура, СМИ и блюда Обработка нитрида кремния (Si 3 N 4) окон. Открыть капсулу слегка сжимая один конец, содержащий окно таким образом, чтобы не сжать саму окно, при вращении другой конец капсулы с другой стороны. Проверить п…

Representative Results

Способность формирования изображений рентгеновским излучением флуоресценции для предоставления информации о биологических образцов зависит от этих образцов готовят таким образом, чтобы они были устойчивы к повреждению излучения на временной шкале эксперимента, и в то же их химичес…

Discussion

Флуоресценции изображений X-Ray полезно во многих областях, в том числе наук о Земле, науки о материалах и химической биологии ^26-34. Достижения в синхротронного рентгеновского излучения, и их фокусировки, дают весьма высокоинтенсивные пучки. Сфокусированный рентгеновских пучков до?…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde