लाइव चूहे के सीरियल इंडोस्कोपिक इमेजिंग का उपयोग आंतों विकृतियों के लिए नई चिकित्सा की प्रभावकारिता के गैर इनवेसिव आकलन

Summary

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Abstract

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

Introduction

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) द्रोह दुनिया भर में ^एक के 4 ^वें सबसे आम कारण है। इस रोग का पारिवारिक आधार के बारे में हमारी समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, आनुवंशिक गड़बड़ी केवल सीआरसी मामलों ^दो की ~ 20% करने के लिए योगदान देता है। शेष जीर्ण सूजन सहित अनेक बाह्य और पर्यावरणीय कारकों को जिम्मेदार ठहराया जाता है। इंसानों में, जीर्ण सूजन और पेट के कैंसर के बीच की कड़ी अल्सरेटिव कोलाइटिस कोलाइटिस जुड़े पेट के कैंसर (सीएसी) के विकास का एक बड़ा खतरा है, जो (यू) के रोगियों में स्पष्ट है, सूजन की बीमारी ^तीन की अवधि, विस्तार और गंभीरता पर निर्भर करता है ^-5। तदनुसार, उपन्यास उपचारों प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और भड़काऊ ट्यूमर microenvironment ^6-8 से विकास को बढ़ावा देने वाले कारकों में से जुड़े उत्पादन को नियंत्रित करने के लिए विकास में हैं। की चिकित्सीय प्रभावकारिता को चिह्नित करने के लिए उपयुक्त पूर्व नैदानिक ​​पशु मॉडल के लिए वहाँ एक बढ़ती आवश्यकता हैविकास और रोग की प्रगति के खिलाफ इन दवाओं।

माउस मॉडल स्पष्ट भड़काऊ microenvironment भी प्रकट सूजन ^9,10 के अभाव में, सीआरसी प्रगति में योगदान देता है कि प्रदर्शन किया है। इन मॉडलों को उपकला चोट और तीव्र और जीर्ण सूजन आंत्र रोग (IBD) ^11,12 मॉडल करने के लिए चूहों के पीने के पानी में प्रदान की पोलीसेकेराइड dextran सल्फेट सोडियम (डीएसएस) का उपयोग करते हैं, शामिल हैं। इस के बारे में mucosal नुकसान और कोलाइटिस लाती व्यवस्था है जिसके द्वारा पूरी तरह से समझ नहीं है, हालांकि कुछ अध्ययनों से इस के बारे कोशिकाओं के भीतर सेलुलर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और ribonuclease गतिविधियों को रोकता है, या colonic झिल्ली क्षति उपकला के लिए अग्रणी के साथ फ्यूज कि नैनो लिपिड परिसरों के गठन को बढ़ावा सुझाव है कि ^13,14। मानक डीएसएस मॉडल में संशोधन भी colonic उपकला कोशिकाओं ऊतक homeostasis और नियमित बनाए रखने के द्वारा जो तंत्र में महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध कराई हैदेर mucosal प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ^15।

Azoxymethane (AOM) की intraperitoneal प्रशासन अकेला, या इस के बारे में संयोजन के साथ, उपकला mucosa और भड़काऊ और स्ट्रोमल microenvironment ^16,17 में दैहिक म्यूटेशन के बीच परस्पर क्रिया की जांच के लिए एक मॉडल प्रदान करता है। AOM सीधे डीएनए उत्परिवर्तन में परिणाम नहीं करता कि कैसरजन 1,2-dimethylhydrazine (DMH) की एक metabolite है। इसके बजाय, AOM एमएएम ग्लुकुरोनिक एसिड के साथ संयुग्मित और फिर पित्त स्राव ¹⁸ के माध्यम से आंत के लिए ले जाया जाता है, जहां जिगर में साइटोक्रोम isoform CYP2E1 द्वारा (mam) methylazoxymethanol को hydrolyzed है। यह जीवाणु β-glucuronidase डीएनए alkylation में जिसके परिणामस्वरूप एमएएम की गिरावट और उपकला कोशिकाओं ¹⁹ में म्यूटेशन के संचय के लिए योगदान देता है कि माना जाता है। अधिकांश AOM प्रेरित colonic ट्यूमर proteasomal degradati के लिए प्रतिरोधी प्रोटीन प्रतिपादन, जीन एन्कोडिंग β-catenin में missense म्यूटेशन बंदरगाहविहित Wnt-संकेतन मार्ग ²⁰ की न्यायपालिका सक्रियण में जो परिणाम पर। AOM की गतिविधि को इस के बारे द्वारा हासिल mucosal क्षति के साथ संयुक्त है, प्रतिक्रिया चिकित्सा आगामी घाव mutagenized उपकला के विकास और विस्तार के लिए अनुकूल है कि एक microenvironment बनाता है। इस मॉडल के विभिन्नता में, अकेले कई सप्ताह की अवधि में AOM का दोहराव प्रशासन इस के बारे प्रेरित कोलाइटिस ^10,17 के अभाव में छिटपुट कोलोरेक्टल कैंसर मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन दो मानार्थ मॉडल एक समर्थक भड़काऊ ट्यूमर microenvironment ¹⁰ के साथ जुड़े रहे हैं, जो दोनों के क्रमश सीएसी और छिटपुट सीआरसी अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग, प्रदान करते हैं।

चूहों में सीरियल एंडोस्कोपी के उपयोग बेकर और उनके सहयोगियों ने ²¹ ने बीड़ा उठाया है, और कोलाइटिस और ट्यूमर प्रगति के अनुदैर्ध्य निगरानी में सक्षम बनाता रहा था। यहाँ हम इस के बारे प्रेरित mucosal नुकसान और / या AOM की मध्यस्थता टीयू के आधार पर तीन पूर्व नैदानिक ​​प्रोटोकॉल प्रदान करते हैंmor के प्रेरण reproducibly विशिष्ट colonic विकृतियों को प्रेरित करने के लिए। पहले प्रोटोकॉल आईबीडी के साथ जुड़े histopathological सुविधाओं के कई बटोर डीएसएस प्रशासन के जवाब में तीव्र mucosal क्षति उत्प्रेरण का वर्णन है। दूसरा प्रोटोकॉल सामान्यतः आईबीडी रोगियों में मनाया सूजन के फ्लेयर्स नकल करने के लिए इस के बारे में प्रशासन की लगातार तीन चक्र पर आधारित है, और AOM प्रेरित परिवर्तन के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है। अंतिम प्रोटोकॉल AOM प्रेरित छिटपुट उपकला म्यूटेशन पर आधारित है। इन प्रोटोकॉल में से प्रत्येक के लिए, हम हम नई दवाओं की प्रभावकारिता की निगरानी के लिए विकसित किया है कि रोगनिरोधी और चिकित्सीय हस्तक्षेप के तरीकों में शामिल करने के लिए प्रासंगिक मानक प्रक्रियाओं पर विस्तार।

Protocol

मेडिकल रिसर्च पशु आचार समिति के वाल्टर और एलिजा हॉल इंस्टीट्यूट इन प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं में से प्रत्येक को मंजूरी दे दी। प्रयोगात्मक चूहों की 1. तैयारी कम से कम 4 लिंग के प्रयोगात्मक साथियों लिखें नस्ल और एक ही विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ़) जानवरों की सुविधा / कमरे में रखे और autoclaved भोजन और पानी के साथ प्रदान की जाती हैं कि 6-8 सप्ताह पुरानी C57BL / 6 चूहों (एम मस्कुलस) मिलान नहीं हुआ। मादा चूहों के उपयोग के विभिन्न लाइनों, सीमा बॉक्स संख्या से चूहों के सह-आवास की अनुमति, और पिंजरे करने वाली पिंजरे भिन्नता कम हो जाएगा। 3.0 मिमी व्यास एंडोस्कोपी म्यान का उपयोग कर एंडोस्कोपी प्रक्रियाओं को सक्षम करने के लिए उम्र के कम से कम छह सप्ताह चूहों कि यह सुनिश्चित कर रहे हैं। जहां संभव आंतों microflora के साथ जुड़े विविधताओं को कम करने के लिए एक ही रैक पर संग्रहीत पिंजरों से, एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों का उपयोग करें, और। पशु सुविधाओं के बीच microflora में बदलाव को ध्यान whe में रखा जाना चाहिएएन प्रत्येक प्रयोग 22 के लिए उपयुक्त नियंत्रण चूहों और जीनोटाइप का निर्धारण। कान / पैर की अंगुली की कतरनों, टैटू, या इसी तरह से मार्क चूहों आसान पहचान के लिए अनुमति देने के लिए। आधारभूत प्रयोगात्मक वजन निर्धारित करने के लिए, 0 दिन पर चूहों वजन। एंडोस्कोपी प्रदर्शन करना आधारभूत colonic phenotypes के रिकॉर्ड करने के लिए 0 दिवस पर चूहों की (धारा 5 देखें)। एक उपकला नुकसान और एक्यूट कोलाइटिस मॉडल में 2. प्री-क्लीनिकल ट्रायल चिकित्सीय एजेंट का एक समाधान तैयार परीक्षण किया जाना है। मौखिक gavage (पीओ) द्वारा वितरित चिकित्सा विज्ञान के लिए, 100 μl की अधिकतम मात्रा के समाधान तैयार करते हैं। Intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) द्वारा वितरित चिकित्सा विज्ञान के लिए, 200 μl की अधिकतम मात्रा के समाधान तैयार करते हैं। नोट: समय की लंबी अवधि से अधिक दोहराया आईपी या पीओ औषधि प्रशासन बदल माउस व्यवहार में परिणाम कर सकते हैं। लंबे समय तक असुविधा से बचने के लिए आईपी इंजेक्शन साइट वैकल्पिक। पीओ प्रशासन के लिए, autoc के साथ चूहों प्रदान करते हैंएक 'इलाज' के रूप में laved सूरजमुखी के बीज gavage प्रक्रिया के साथ प्रतिकूल एसोसिएशन को कम से कम करने के लिए। 1 दिन पर, ब्याज (2.1 कदम में तैयार) और उपयुक्त वाहन नियंत्रण की चिकित्सीय प्रशासन। उदाहरण प्रदान की (चित्रा 6A), पुनः संयोजक मानव (आरएच) iInterleukin (आईएल) के 5 माइक्रोग्राम प्रति -11 प्रोटीन 200 μl फॉस्फेट बफर खारा में भंग कर दिया गया में (पीबीएस) और प्रशासित आईपी । परीक्षण किया जा रहा है कि चिकित्सीय अभिकर्मक के लिए स्थापित फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल पर निर्भर हो जाएगा जो प्रशासन, के समय और आवृत्ति निर्धारित एक प्रयोग के कोर्स पर दो बार दैनिक आईपी इंजेक्शन का उपयोग कर रोगनिरोधी उपचार रूपरेखा चित्रा। मल स्थिरता और रक्त की उपस्थिति सहित, मॉनिटर, और दैनिक प्रत्येक माउस तौलना। उपचार के दिन पर, चिकित्सकीय दवा के प्रशासन के साथ मेल खाना चाहिए वजन दोहराया से निपटने की वजह से चूहों को तनाव कम करने के लिए। </lमैं> 3 दिन, 2.5% (2.5 ग्राम / 100 मिलीलीटर) नियमित तौर पर जानवरों की सुविधा के द्वारा चूहों के लिए प्रदान की पीने के पानी में इस के बारे समाधान तैयार है। लगभग 5 मिलीग्राम / माउस / डीएसएस समाधान के दिन प्रयोग के लिए आवश्यक है। जानवरों की सुविधा के परिवेश के तापमान उतार चढ़ाव होता रहता अगर इस के बारे पानी की खपत बदल सकते हैं। नोट: इस के बारे में एक अड़चन है और एमएसडीएस निर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए। 5 सतत दिनों के लिए साफ पानी की बोतलों में चूहों यथेच्छ करने के लिए नए सिरे से इस के बारे प्रदान करें। 5 दिन की शाम को, मसला हुआ भोजन छर्रों के लिए इसके अलावा और छोटे पेट्री डिश (100 ग्राम भोजन छर्रों / 10 ग्राम प्रोटीन शेक / 10 मिलीलीटर पानी) में उपलब्ध कराई गई एक प्रोटीन के पूरक में सामान्य पीने के पानी उपलब्ध कराते हैं। इस निर्जलीकरण से बचाता है और गंभीर वजन-नुकसान को न्यूनतम के साथ मदद करता है। सीओ 2 नशा द्वारा चूहों euthanize और दिवस 8, या की सुबह पर बाद में ऊतकीय विश्लेषण के लिए ऊतकों इकट्ठा चूहों तीन से अधिक ग के लिए ≥15% वजन कम करने का अनुभव है जबपहली बार होता है, जो भी onsecutive दिनों। नोट: 1-4% के बीच इस के बारे खुराक को समायोजित (w / v) जानवरों की सुविधा के microflora और DSS के बैच के आधार पर। उपयुक्त डीएसएस खुराक और नाकाम बैच करने वाली बैच विभिन्नता स्थापित करने के लिए, दिनचर्या बैच के परीक्षण के लिए बाहर ले। उचित खुराक वजन घटाने (मूल वजन की नहीं अधिक से अधिक से अधिक 15%) पर आधारित है और कोलाइटिस ऊतकविकृतिविज्ञानी पुष्टि की जानी चाहिए। एक पुरानी बृहदांत्रशोथ या कोलाइटिस से जुड़े कैंसर मॉडल में 3. प्री-क्लीनिकल ट्रायल पुरानी कोलाइटिस मॉडल के लिए कदम 3.7 से शुरू करते हैं। कोलाइटिस से जुड़े कैंसर (सीएसी) मॉडल के लिए, 1 दिन, 10 मिलीग्राम / किग्रा (डब्ल्यू / डब्ल्यू) Azoxymethane (AOM, 250 μl, आईपी) के साथ प्रत्येक माउस इंजेक्षन। नोट: AOM एक कैसरजन और एमएसडीएस निर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए। AOM के शेयर समाधान 10 मिलीग्राम / एमएल aliquots के रूप में तैयार किया है और -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है। इंजेक्शन के दिन, AOM शेयर समाधान thawed है और 1 मिलीग्राम / मी के लिए पतलापीबीएस में एल। बार-बार ठंड और AOM शेयर समाधान के विगलन से बचा जाना चाहिए। AOM खुराक 8-12 मिलीग्राम / किग्रा के बीच समायोजित किया जा सकता है। नियमित बैच के परीक्षण के कारण बैच करने वाली बैच विभिन्नता के लिए चूहों को विषाक्तता नाकाम करने के क्रम में उपयुक्त AOM खुराक स्थापित करने के लिए आवश्यक है। दिन 1-7 के दौरान AOM प्रशासन वजन स्थिर हो जाएगा के बाद और इस कारण के लिए वजन की निगरानी उनके मल में साइटोटोक्सिक चयापचयों उगलना होगा कि हैंडलिंग जानवरों से बचने के लिए दिन 1-7 के दौरान छोड़े गए किया जा सकता है। 7 दिन पर सभी का बिस्तर साइटोटोक्सिक प्रक्रियाओं का पालन बदलने की जरूरत है। बिस्तर परिवर्तन पूरा हो गया है एक बार वे अब साइटोटोक्सिक चयापचयों excreting किया जाएगा, के रूप में पशुओं को नहीं रह गया है, साइटोटोक्सिक हैंडलिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। दिवस 8 पर, 2.5% (2.5 ग्राम / 100 मिलीलीटर) (2.5 कदम के रूप में वर्णित) डीएसएस समाधान तैयार है और चूहों यथेच्छ करने के लिए प्रदान करते हैं। झालरदार फू सहित, प्रयोग के दौरान दैनिक चूहों का वजन और बीमारी के लक्षण के लिए की निगरानीआर, खूनी दस्त और कम आंदोलन hunching। 13 दिन पर, इस के बारे समाधान निकालने और 28 दिन 8-28 पुरानी कोलाइटिस / सीएसी प्रोटोकॉल में से एक 'चक्र' का गठन दिन तक सामान्य पीने के पानी के साथ चूहों प्रदान करते हैं। दिन 13-28, पर चूहों सामान्य पीने के पानी दिया जाता है, जब मसला हुआ भोजन छर्रों के साथ चूहों और छोटे पेट्री डिश (100 ग्राम भोजन छर्रों / 10 ग्राम प्रोटीन शेक / 10 मिलीलीटर पानी) में उपलब्ध कराई गई एक प्रोटीन के पूरक प्रदान करते हैं। इस निर्जलीकरण से बचाता है और गंभीर वजन-नुकसान को न्यूनतम के साथ मदद करता है। नोट: मुहब्बत में प्रोटीन की खुराक चूहों को इस के बारे खपत में स्थिरता सुनिश्चित करने के क्रम में पीने के पानी को इस के बारे युक्त प्राप्त कर रहे हैं जब प्रदान किया जा नहीं करना चाहिए। दिवस 20 (धारा 5 देखें) व्यक्तिगत माउस स्वास्थ्य पर नजर रखने के लिए दूसरा इंडोस्कोपिक परीक्षा प्रदर्शन करते हैं। दिवस 29 दोहराने पर इस के बारे चक्र (साइकिल 2: 2.5% (v) के दिन 34-50 के दौरान दिन 29-33 और सामान्य पीने के पानी के दौरान प्रदान DSS / डब्ल्यू)। दिवस पर 40 थी प्रदर्शनव्यक्तिगत माउस स्वास्थ्य पर नजर रखने और ट्यूमर बोझ निर्धारित करने के लिए इंडोस्कोपिक परीक्षा आरडी (धारा 5 देखें)। कोई ट्यूमर दिवस 40 पर एंडोस्कोपी से दिखाई दे रहे हैं, तो दिन 50-72 पर एक तिहाई इस के बारे चक्र शुरू (चक्र 3: 2.5% (/ वी) दिन 56-72 के दौरान दिन 50-55 और सामान्य पीने के पानी के दौरान प्रदान DSS डब्ल्यू)। आम तौर पर, ट्यूमर दिवस 40 से दिखाई दे रहा है और इसलिए इस के बारे के तीसरे चक्र छोड़ा जा सकता है। ट्यूमर इंडोस्कोपिक परीक्षा से दृष्टिगोचर हो जाने के बाद, प्रत्येक माउस के एक इंडोस्कोपिक ट्यूमर स्कोर (धारा 5 देखें) आवंटित करने और इसी तरह की आधारभूत ट्यूमर बोझ के साथ साथियों के लिए व्यक्तिगत चूहों आवंटित। (ट्यूमर दिखाई दे रहे हैं, जब या) दिवस 42 को, चिकित्सीय परिसर या प्रासंगिक वाहन नियंत्रण (खंड 2.2 देखें) प्रशासन। खुराक के समय चिकित्सकीय की फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल पर निर्भर हो जाएगा। एक हस्तक्षेप के उपचार का एक उदाहरण प्रदान की जाती है स्थापित ट्यूमर (चित्रा 2) के साथ चूहों में तीन बार साप्ताहिक आईपी इंजेक्शन। ई सम्पन्नचिकित्सीय उपचार की अवधि से अधिक प्रति सप्ताह एक बार ndoscopic परीक्षा ट्यूमर बोझ नजर रखने के लिए। आम तौर पर, एक चिकित्सीय उपचार के 4 हफ्तों के एक उद्देश्य के उपचार प्रतिक्रिया निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त है। उपचार की समाप्ति के बाद, चूहों की एक पलटन भी ट्यूमर पतन के लिए एंडोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है। सीओ 2 नशा द्वारा चूहों euthanize और चूहों से अधिक लगातार तीन दिनों के लिए ≥15% वजन कम करने का अनुभव है जब या, पहली बार होता है, जो भी दिवस 72 की सुबह जैव रासायनिक और / या ऊतकीय विश्लेषण के लिए ऊतकों इकट्ठा। एक छिटपुट कोलोरेक्टल कैंसर मॉडल में 4. प्री-क्लीनिकल ट्रायल 1 दिन, 10 मिलीग्राम / किग्रा AOM (3.2 कदम देखें) के साथ प्रत्येक माउस आईपी इंजेक्षन। AOM खुराक 8-12 मिलीग्राम / किग्रा के बीच समायोजित किया जा सकता है। नियमित बैच के परीक्षण के कारण बैच करने वाली बैच विभिन्नता के लिए चूहों को विषाक्तता नाकाम करने के क्रम में उपयुक्त AOM खुराक स्थापित करने के लिए आवश्यक है। प्रत्येक सप्ताह के पहले दिन इंजेक्शन दोहराएँनिम्नलिखित 5 हफ्तों के लिए (चित्रा 3)। चूहों पूरे 6 सप्ताह के लिए साइटोटोक्सिक सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए। दोहराया से निपटने की वजह से चूहों को संकट को कम करने के लिए AOM इंजेक्शन के दिन प्रत्येक माउस वजन। नोट: AOM एक कैसरजन और एमएसडीएस निर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए। सभी जानवरों को इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक AOM आईपी इंजेक्शन के 6 सप्ताह के लिए साइटोटोक्सिक सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए। 8 सप्ताह के दौरान उभरते ट्यूमर (धारा 5 देखें) के लिए नजर रखने के लिए इंडोस्कोपिक परीक्षा प्रदर्शन करते हैं। ट्यूमर दिखाई देने लगते हैं, जब तक इंडोस्कोपिक परीक्षा हर दो हफ्ते प्रदर्शन किया जाना चाहिए। आम तौर पर, जंगली प्रकार C57BL / 6 जानवरों AOM की प्रारंभिक प्रशासन के बाद लगभग 40 सप्ताह से ट्यूमर विकसित करने के लिए शुरू करते हैं। ट्यूमर इंडोस्कोपिक परीक्षा से दृष्टिगोचर हो जाने के बाद, प्रत्येक माउस के एक इंडोस्कोपिक ट्यूमर स्कोर असाइन (धारा 5 देखें) और इसी तरह के साथ एक पलटन को व्यक्तिगत चूहों असाइन चिकित्सकीय उपचार के प्रारंभ करने से पहले ट्यूमर बोझ। (ट्यूमर दिखाई दे रहे हैं पहले जब या) सप्ताह 40 के दौरान, चिकित्सीय परिसर या प्रासंगिक वाहन नियंत्रण प्रशासन। खुराक के समय चिकित्सकीय की फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल पर निर्भर हो जाएगा (2.1 कदम देखें)। एक हस्तक्षेप के उपचार का एक उदाहरण प्रदान की जाती है स्थापित ट्यूमर (चित्रा 3) के साथ चूहों में 3 बार साप्ताहिक आईपी इंजेक्शन। ट्यूमर बोझ नजर रखने के लिए चिकित्सीय उपचार की अवधि की अवधि के लिए इंडोस्कोपिक परीक्षा साप्ताहिक प्रदर्शन करते हैं। आम तौर पर, एक चिकित्सीय उपचार के 4 हफ्तों के एक उद्देश्य के उपचार प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त है। उपचार समाप्ति के बाद, चूहों की एक पलटन भी ट्यूमर पतन के लिए एंडोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है। सीओ 2 नशा द्वारा चूहों euthanize और सप्ताह 45, या चिकित्सा के चार सप्ताह के निम्न दौरान कोलोन और ट्यूमर के जैव रासायनिक और / या ऊतकीय विश्लेषण के लिए ऊतकों इकट्ठा। > 5 ve_title "। इंडोस्कोपिक परीक्षाएं एंडोस्कोपी उपकरण मानक प्रक्रियाओं 16 के अनुसार इकट्ठे किया जाना चाहिए। जीवाणुरहित और 70% इथेनॉल या एक एंटी-बैक्टीरियल स्नेहक के साथ एंडोस्कोप जांच साफ। विडियो ऐसे iMovie के रूप में एक लैपटॉप या डेस्कटॉप कंप्यूटर और मानक मीडिया सॉफ्टवेयर, का उपयोग कर दर्ज की जा सकती है। एक मानक कंप्यूटर मॉनिटर, बजाय एक चिकित्सा ग्रेड मॉनिटर, एंडोस्कोपी प्रक्रिया (चित्रा 4) के दौरान पेट के कल्पना करने के लिए पर्याप्त है। 0.2-0.4 एल / मिनट की दर पर एक साथ 100% ओ 2 में 3% isoflurane के साथ एक कक्ष में 5-6 चूहों के समूह anesthetize। पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा पुष्टि की है जो anesthetized हैं चूहे, एक बार; isoflurane के स्तर को रखरखाव के लिए 0.5-2% करने के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए। कक्ष से एक व्यक्ति माउस निकालें, और एक नाक-कोन में सुरक्षित अपने सिर के साथ यह उदर पक्ष रखें। पूर्ण संज्ञाहरण निगरानी की जानी चाहिए और वे एस रहे हैं इतना है कि पिछले पैरों समायोजित किया जाना चाहिएमाउस के पीछे बाहर tretched। सूखापन को रोकने के लिए चूहों की आंखों पर एक पशु चिकित्सक मरहम रखें। यह स्पष्ट रूप से गुदा प्रकट करने के लिए कम रीढ़ से मिलता है जहां माउस की पूंछ पकड़ो। पानी की एक बीकर में कठोर एंडोस्कोप म्यान डालें और एक समय में एक छोटे बुलबुले की रिहाई की अनुमति देने के लिए airflow समायोजित करें। airflow के पेट के फुलाना करने की अनुमति होगी। Airflow के भी मजबूत है, तो हवा माउस के पेट में पंप किया जाएगा। कोई अतिरिक्त स्नेहन की आवश्यकता है। ध्यान से मलाशय में कठोर एंडोस्कोप म्यान डालें। आम तौर पर, एंडोस्कोप चूहों घटता में पेट के बिंदु और कठोर एंडोस्कोप के लिए सुलभ नहीं है, जिस पर 3 सेमी, अप करने के लिए डाला जा सकता है। एंडोस्कोपी प्रक्रियाओं के दौरान एक आम कठिनाई की वजह से fecal बात करने के लिए पेट के के लुमेन के लिए उपयोग की रुकावट है। धीरे feca चारों ओर एंडोस्कोप युद्धाभ्यास ध्यान से शौच के लिए प्रोत्साहित करने के लिए प्रक्रिया से पहले चूहों के पेट की मालिश, या द्वारा इस से बचेंप्रक्रिया के दौरान एल बात। Peristalsis भी पेट के मांसलता को आराम तक के दौरान जो एंडोस्कोप स्थिति में आयोजित किया जाना चाहिए, हो सकता है। एंडोस्कोपी प्रक्रिया के किसी भी चरण में वीडियो रिकॉर्डिंग आरंभ करें। रोग स्कोरिंग प्रक्रिया के दौरान एक अनुभवी सहायक द्वारा दर्ज की गई, या वीडियो फ़ाइलों से एक बाद में समय बिंदु पर किया जा सकता है। इंडोस्कोपिक परीक्षा के बाद, उनके पिंजरे में चूहों लौटने और संज्ञाहरण से वसूली के दौरान उन पर नजर रखने। पशु isoflurane के प्रशासन के नाक शंकु से हटाने के बाद दो मिनट के भीतर आम तौर पर जाग और मोबाइल हैं। इन प्रक्रियाओं के एक अनुभवी वैज्ञानिक के द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। प्रत्येक एंडोस्कोपी प्रक्रिया माउस के अनुसार लगभग 2 मिनट का समय लगेगा। 6. रोग स्कोरिंग (मैं) में परिवर्तन दस्तावेजों जो कोलाइटिस गंभीरता के Murine इंडोस्कोपिक सूचकांक (MEICS) 16, पारदर्शिता द्वारा संकेत पेट के दीवार की मोटाई के लिए वीडियो स्कोर, कोलाइटिस निगरानी करने के लिए(Ii) (iv) एक बारीक फैशन में है कि वर्तमान अल्सर और उत्थान के क्षेत्रों, (वि) जमा (चित्रा 5A) आतंच ने संकेत दिया खून बह रहा मल स्थिरता, (iii) की रक्त वाहिनियों की अखंडता और उपस्थिति,। ट्यूमर बोझ की निगरानी करने के लिए, ट्यूमर घटना और आकार के लिए वीडियो स्कोर। ट्यूमर के आकार का ट्यूमर 16 (चित्रा 5 ब) के कब्जे में colonic लुमेन के व्यास से निर्धारित होता है। यह एक माउस के लिए दोनों कोलाइटिस और ट्यूमर स्कोरिंग मापदंडों का उपयोग करने के लिए आम बात है। एंडोस्कोपी, व्यक्तिगत ट्यूमर और colonic mucosa के स्वास्थ्य का प्रयोग एक भी पशु में नए चिकित्सा विज्ञान की सफलता के लिए एक पढ़ने के लिए बाहर उपलब्ध कराने, समय पर नजर रखी जा सकती है। (वैकल्पिक) अभी भी छवियों प्रतिनिधि आंकड़े (चित्रा 6) की पीढ़ी के लिए वीडियो से निकाला जा सकता है।

Representative Results

वजन घटाने नियमित तौर पर चूहों के समग्र स्वास्थ्य पर नजर रखने के लिए किया जाता है जो कोलाइटिस, के साथ जुड़े रोग के लिए नजर रखने के लिए एक मानक पैरामीटर के रूप में प्रयोग किया जाता है। पशु डीएसएस युक्त पानी प्रशासित किया जाता है, जबकि आम तौर पर अपने वजन को बनाए रखने, और वे सामान्य पीने के पानी के लिए लौट रहे हैं जब केवल वजन कम करने के लिए शुरू करते हैं। स्वीकार्य वजन घटाने के मापदंडों संस्था के पशु आचार समिति के अनुसार स्थापित किया जाना चाहिए। लंबे समय तक दस्त के साथ जुड़े निर्जलीकरण को रोकने मुहब्बत की दिनचर्या प्रावधान का उपयोग करने के क्रम में (खाद्य छर्रों मसला हुआ और पीने के पानी के साथ मिश्रित) सामान्य पीने के पानी के अलावा एक प्रोटीन शेक के साथ पूरक। एक वैकल्पिक संज्ञाहरण, Ketamine / xylazine या इसी तरह के एजेंटों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर isoflurane के उपकरण उपलब्ध नहीं है। कारण एंडोस्कोप की कठोर प्रकृति के कारण, इन प्रक्रियाओं केवल माउस बृहदान्त्र के सबसे बाहर का 3 सेमी के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं। साथ नए एंडोस्कोप (लचीलापन और प्रतिदीप्ति सहित) अतिरिक्त क्षमताओं के प्रयोग की जरूरतों के आधार पर उपलब्ध हैं। DSS के हानिकारक प्रभाव मुख्य रूप से मध्यम बृहदान्त्र में मनाया मामूली विकृति के साथ चूहों के बाहर का बृहदान्त्र, के लिए सीमित कर रहे हैं हालांकि, बाद से, कठोर एंडोस्कोप व्यक्तिगत चूहों के mucosal स्वास्थ्य की निगरानी में बाधा नहीं है। हम तीव्र डीएसएस प्रेरित कोलाइटिस के रोगनिरोधी उपचार के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, इस प्रोटोकॉल आसानी से हस्तक्षेप उपचार रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उपकला नुकसान और कोलाइटिस कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक दवा की प्रभावकारिता व्यक्तिगत चूहों में अनुलंबीय नजर रखी और वर्णित स्कोरिंग मानकों (चित्रा 5) के आधार पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के दौरान विशिष्ट समय बिंदुओं पर चूहों की मुर्गियों को मारने की आवश्यकता होती है, जो परंपरागत प्रयोगात्मक डिजाइन, अधिक लाभप्रद है, और समय के साथ एक के इलाज के लिए बीमारी की प्रतिक्रिया के लक्षण वर्णन अनुमति नहीं देता है। टी "> मानव में नैदानिक ​​अध्ययन एक व्यक्ति रोगी में उपचार का जवाब कैसे अलग ट्यूमर में काफी परिवर्तनशीलता को उजागर किया है। यहां बताई गई प्रक्रियाओं समग्र ट्यूमर बोझ है, साथ ही पाठ्यक्रम पर व्यक्तिगत ट्यूमर के इलाज प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने के एक प्रयोग के। यह कैंसर मॉडलों के लिए रेखांकित कर रहे हैं कि हस्तक्षेप प्रोटोकॉल खाते में ट्यूमर दीक्षा पर एक चिकित्सा के प्रभाव से नहीं लेते हैं कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। रोगनिरोधी प्रोटोकॉल, ट्यूमर एंडोस्कोपी से दिखाई देने लगते हैं, जब करने से पहले उपलब्ध कराए गए उपचार के साथ, इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल प्रगति पर पर उपचारात्मक प्रभाव के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के व्यक्तिगत ट्यूमर के (ट्यूमर के आकार से मापा जाता है)। ट्यूमर प्रतिगमन भी दिखाई दे ट्यूमर की संख्या में कमी ने संकेत दिया जा सकता है। जी "/> चित्रा 1:। तीव्र colonic क्षति के एक मॉडल में एक रोगनिरोधी उपचार चिकित्सा की प्रभावकारिता निगरानी (क) प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल शुरू से पूरा करने के लिए आठ दिनों की आवश्यकता है। चिकित्सा विज्ञान रोगनिरोधी उपचार के लिए 1 दिन से (ख) प्रशासित रहे हैं। इस के बारे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के 3 दिन से पीने के पानी (ग) में प्रदान की जाती है। एंडोस्कोपी पशुओं में रोग प्रगति की निगरानी के लिए (डी) किया जाता है। सुझाव timepoints, दिन 5 और 8 (रोग बोझ निर्धारित करने के लिए) 0 दिन (इलाज) और दिन 2 (स्वास्थ्य की निगरानी) शामिल हैं। प्रयोग एक जंगली प्रकार माउस (च) समय के साथ बीमारी बढ़ जाती है की प्रगति में दिवस 8. (ई) सुबह समाप्त होता है। चित्रा 2: एक मॉडल ओ में हस्तक्षेप चिकित्सा की प्रभावकारिता की निगरानीएफ कैंसर कोलाइटिस से जुड़े। (क) प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल शुरू से पूरा करने के लिए 72 दिनों की आवश्यकता है। (ख) चिकित्सा हस्तक्षेप के उपचार के लिए दिन में 46 से स्थापित ट्यूमर के साथ चूहों को दिलाई कर रहे हैं। AOM (ग) 1 दिवस पर इंजेक्ट किया जाता है, और इस के बारे 8. एंडोस्कोपी (डी) पशुओं में रोग प्रगति की निगरानी करने के लिए किया जाता है दिवस पर शुरुआत, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के तीन चक्रों के पाठ्यक्रम पर पीने के पानी में प्रदान की जाती है। सुझाव timepoints (समूह जानवरों के लिए ट्यूमर बोझ के अनुसार) दिवस (इलाज) 0, दिन 20 (स्वास्थ्य की निगरानी), और दिन में 40 शामिल हैं। एंडोस्कोपी रोग के परिणामों पर नजर रखने के लिए चिकित्सीय उपचार के पाठ्यक्रम पर साप्ताहिक प्रदर्शन किया है। प्रयोग (ई) के बाद 40 दिन से बढ़ जाती है एक जंगली प्रकार माउस (च) ट्यूमर बोझ में दिवस 72 की सुबह समाप्त होता है। <img alt="चित्र तीन"src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 52,383 / 52383fig3highres.jpg" /> चित्रा 3:। सहज कोलोरेक्टल कैंसर के एक मॉडल में हस्तक्षेप चिकित्सा की प्रभावकारिता निगरानी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (क) शुरू से ही पूरा करने के लिए> 50 सप्ताह की आवश्यकता है। (ख) चिकित्सा हस्तक्षेप के उपचार के लिए स्थापित ट्यूमर के साथ चूहों को दिलाई कर रहे हैं। AOM (ग) प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के पाठ्यक्रम पर साप्ताहिक उसके बाद लगातार 6 इंजेक्शन के लिए 1 दिन पर इंजेक्ट किया जाता है, और। एंडोस्कोपी (डी) पशुओं में रोग प्रगति की निगरानी करने के लिए किया जाता है। सुझाव timepoints सप्ताह में दो बार वहाँ (ट्यूमर बोझ स्थापित करने के लिए) के बाद दिवस 0 (इलाज) और 8 सप्ताह (ट्यूमर निगरानी) और शामिल हैं। एंडोस्कोपी चिकित्सकीय परिणामों पर नजर रखने के उपचार के पाठ्यक्रम पर साप्ताहिक प्रदर्शन किया है। प्रयोग (ई) के बाद सप्ताह में 40 से बढ़ जाती है एक जंगली प्रकार माउस (च) ट्यूमर बोझ में सप्ताह 50 में समाप्त होता है। </p> चित्रा 4:। उपकरण सेट-अप के उपकरणों के अलग-अलग टुकड़ों के साथ इंडोस्कोपिक इकाई के लिए प्रयोगात्मक सेट अप (एक), संकेत दिया। व्यक्तिगत घटकों के साथ कठोर एंडोस्कोप (ख), संकेत दिया। स्केल बार = 2.5 सेमी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 5:। एंडोस्कोपी से स्कोरिंग की बीमारी मापदंडों एक रूपरेखा (क) कोलाइटिस गंभीरता के Murine इंडोस्कोपिक सूचकांक (MEICS) के। व्यक्तिगत ट्यूमर स्कोरिंग मापदंडों की एक रूपरेखा (ख)।तों / ftp_upload / 52,383 / 52383fig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 6: प्रतिनिधि चिकित्सीय उपचार प्रतिनिधि वजन घटाने के लिए इंडोस्कोपिक छवियों और स्कोर:। (क) एक्यूट mucosal क्षति डीएसएस प्रेरित (ख) अनुक्रमिक बाद विकसित किया है कि AOM / डीएसएस प्रोटोकॉल के बाद विकसित की कि ट्यूमर (ग) ट्यूमर।। AOM प्रोटोकॉल। समूह के अनुसार एन = 3 चूहों। * पी <0.05, *** पी <0.001 (छात्र की टी परीक्षण)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

चूहों में colonic रोग विकृति विज्ञान के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रेरण की रूपरेखा तरीकों का वर्णन किया गया हैं कि तीन प्रोटोकॉल। दिनचर्या इंडोस्कोपिक निगरानी और यहाँ उल्लिखित हस्तक्षेप रणनीतियों के साथ संयुक्त, इन प्रोटोकॉल चिकित्सा विज्ञान की प्रभावकारिता में शक्तिशाली पूर्व नैदानिक ​​अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। हमारी प्रयोगशालाओं नियमित उपन्यास चिकित्सा विज्ञान ^10,23,24 की सफलता की निगरानी करने के लिए इन प्रोटोकॉल के सभी का उपयोग करें।

एक पूर्व नैदानिक ​​पशु मॉडल चुनने नई चिकित्सा परीक्षण करने के लिए जब विचारों की एक संख्या हैं। ये मानव रोग के लिए मॉडल की प्रासंगिकता, और चिकित्सीय लक्ष्य की प्रस्तावित कार्रवाई के लिए ट्यूमर microenvironment का योगदान शामिल है। यहाँ हम स्थापित आंत्र रोग मॉडल में चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए तीन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इन मॉडलों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होते हैं और रोग को उत्पन्न करने के लिए अभिकर्मकों के वितरण का प्रबंधन करने के लिए आसान है। महत्वपूर्ण बात है, मॉडल अत्यधिक प्रासंगिक हैंकई पहलुओं और कोलाइटिस शुरुआत की, और ट्यूमर दीक्षा और प्रगति के चरणों के लिए। शोधकर्ताओं ने काफी ²⁵ अलग-अलग हो सकता है इस के बारे में और / या AOM द्वारा प्रेरित रोग के लिए खतरा के रूप में, ध्यान में प्रयोगों को डिजाइन का इस्तेमाल किया जब माउस उपभेदों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि लेना चाहिए। इसके अलावा, विभिन्न सूक्ष्म समुदायों बैक्टीरिया द्वारा metabolized है जो AOM, के संदर्भ में विभिन्न चयापचय क्षमता हो सकती है। हम एक ही प्रयोग में (वाणिज्यिक विक्रेताओं सहित) विभिन्न जानवरों की सुविधाओं में पैदा हुए थे कि चूहों के विभिन्न साथियों उपयोग करने के खिलाफ चेतावनी देते हैं। इसी प्रकार, विभिन्न सुविधाओं से इस्तेमाल चूहों में अलग microflora अलग मेजबान प्रतिक्रियाओं उपकला बाधा क्षति ¹¹ प्रेरित DSS को प्रकाश में लाना हो सकता है। इसके अलावा, (उदाहरण के शाही सेना शुद्धि के लिए) ऊतक का उचित विश्लेषण भी बाद में आणविक विश्लेषण ^26,27 पर असर होगा रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को बाधित करने के लिए डीएसएस की क्षमता, के बाद से विचार किया जाना चाहिए।

<p claएस एस = "jove_content"> माउस एंडोस्कोपी बार बार एक व्यक्ति माउस में रोग शुरुआत और प्रगति की निगरानी के लिए एक अत्याधुनिक तकनीक है। वीडियो रिकॉर्ड और अभी भी छवियों निकालने की क्षमता कई रोग मापदंडों और ट्यूमर के लिए आसान निगरानी परमिट। पशु कल्याण में सुधार के अलावा, इंडोस्कोपिक निगरानी भी परंपरागत रूप से रोग परिणाम ट्रैक करने के लिए अलग-अलग समय अंक में मारी गईं थे जो प्रयोगात्मक चूहों के कई साथियों, के लिए की जरूरत कम कर देता है। MEICS स्कोरिंग प्रणाली histopathological विश्लेषण के लिए एक विकल्प नहीं है, बल्कि एक वैकल्पिक लाइव चूहों में पशु स्वास्थ्य और mucosal क्षति की निगरानी करने के लिए साधन प्रदान करता है। माउस एंडोस्कोपी एक विशेष प्रयोगशाला तकनीक है, और सभी प्रक्रियाओं चूहों का उचित हेरफेर और हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए, साथ ही रोग स्कोरिंग के लिए इस्तेमाल किया छवियों में लगातार गुणवत्ता प्रदान करने के लिए प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए। योग्य व्यक्तिगत के हाथों में, हम एंडोस्कोपी tumo करने के लिए बहुत कम या कोई नुकसान लाती ने पाया है किइंट्रा-tumoral रक्तस्राव का कारण होता है कि रुपये। यह प्रारंभिक ट्यूमर बोझ निर्धारित करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है, और एक चिकित्सकीय दवा के प्रशासन के पहले इसी तरह के ट्यूमर बोझ के साथ पशुओं के समूह साथियों के लिए हमें की अनुमति देता है के बाद से उल्लिखित चिकित्सकीय प्रोटोकॉल के लिए, हम, एंडोस्कोपी अत्यधिक लाभप्रद विचार करें। चूहों के अनुक्रमिक निगरानी एक समय पर ढंग से असफल प्रयोगों समाप्त के विकल्प के साथ, पर जल्दी उपन्यास उपचारों की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम बनाता है।

भड़काऊ आंत्र रोग और कोलोरेक्टल कैंसर अग्रिम के बारे में हमारी समझ के रूप में, चिकित्सा के लिए नए लक्ष्य की पहचान की जाएगी। उपयुक्त पशु मॉडल सबसे होनहार नए उपचारों क्लिनिकल परीक्षण की ओर स्थानांतरित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए अभिन्न हो जाएगा।

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000)	MP Biochemicals	160110	Requires batch testing.
Azoxymethane	Sigma	A5486-100MG	Requires batch testing.
Vanilla Protein Shake	N/A	N/A	Available from hospital pharmacies.
Isoflourane	PPC	M60303	This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key.
70% Ethanol	N/A	N/A	Standard lab reagent.
Coloview miniendoscopic system
Endovision Tricam	Karl Storz	20212001-020
Xenon 175 light source with anti-fog pump	Karl Storz	20134001
HOPKINS straight Forward Telescope	Karl Storz	64301AA
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm)	Kalr Stroz	61029C
Fubre Optic Light Cable	Kalr Stroz	69495ND
Computer and media player software	MAC, imovies
Scale	Any		Any scale suitable for weighing mice.