Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

Résumé

Les moustiques transmettant le paludisme présentent un certain nombre de caractéristiques épidémiologiquement importantes qui ne peuvent être détectées qu’à l’aide de techniques moléculaires. À l’aide d’une plateforme de génotypage SNP basée sur MALDI-TOF, nous avons mis au point un test permettant de détecter simultanément plusieurs traits clés (espèce, résistance aux insecticides, infection parasitaire et choix de l’hôte) des vecteurs du paludisme.

Résumé

Le complexe d'espèces Anopheles gambiae comprend le principal moustiques transmettent le paludisme en Afrique. Parce que ces espèces sont d'une telle importance médicale, plusieurs traits sont généralement caractérisés par des tests moléculaires pour aider dans les études épidémiologiques. Ces caractéristiques comprennent l'identification des espèces, la résistance aux insecticides, l'état de l'infection par le parasite, et de préférence d'hôte. Comme les populations du complexe Anopheles gambiae sont morphologiquement indiscernables, une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est traditionnellement utilisée pour identifier les espèces. Une fois l'espèce est connue, plusieurs essais sont régulièrement effectuées en aval pour élucider d'autres caractéristiques. Par exemple, des mutations connues sous le nom de KDR dans un gène par confèrent une résistance contre le DDT et les pyréthrinoïdes. En outre, les dosages d'enzyme-linked immunosorbent (ELISA) ou Plasmodium essais de PCR de détection de l'ADN du parasite sont utilisés pour détecter les parasites présents dans les tissus de moustiques. Enfin, une combination de la PCR et digestion de l'enzyme de restriction peut être utilisée pour élucider préférence de l'hôte (par exemple, humain contre le sang animal) par criblage de la farine de sang de moustique pour l'ADN spécifique à l'hôte. Nous avons développé un essai multi-détection (MDA) qui combine tous les tests mentionnés ci-dessus dans un seul multiplex 33SNPs réaction de génotypage pour 96 ou 384 échantillons à la fois. Parce que le MDA comprend de multiples marqueurs pour les espèces, Plasmodium détection, l'identification et de l'hôte dans le sang, la probabilité de générer des faux positifs ou négatifs est fortement réduite à partir de dosages précédentes comprenant un seul marqueur par trait. Ce test robuste et simple peut détecter ces traits de moustiques clés rentable et en une fraction du temps de tests existants.

Introduction

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii et Anopheles gambiae sont les principaux vecteurs responsables de la transmission du paludisme en Afrique ^1. Ces trois espèces sont morphologiquement indiscernables ² et ne peuvent être distingués par des analyses moléculaires ^9.3. En outre, il existe de nombreux tests en aval régulièrement menées pour faciliter les études de génétique épidémiologique et de la population. Il se agit notamment (1) un test de génotypage pour les îles de spéciation ^10-12, (2) un test de génotypage reconnaissant SNP non synonymes dans le 1014 ^ème acide aminé en position de co....

Protocole

1. Amplification par PCR

1. Mélanger tous les amorces de PCR (Voir Tableau supplémentaire S1) dans un microtube de 1,5 ml. Chaque SNP a deux amorces (avant et arrière). Assurez-vous que la concentration de l'action de chaque amorce PCR est maintenue à 100 um. Faire assez mélange d'amorces pour les réactions 500-1000 pour réduire pipetage erreur et le temps sur le banc (Voir Tableau supplémentaire S2). Si vous le souhaitez, pour préparer des aliquotes de 100 à 200 réactions par tube et conserver à -20 ° C.
2. Préparer cocktail de PCR tel que décrit dans le protocole du fabricant (tableau 1). Le volume de réaction 96 comprend un surplomb de 20%. ....

Résultats

L'identification des espèces:

Les cinq SNP suivants ensemble identifient trois espèces (A. arabiensis, A. et A. gambiae coluzzii) (tableau 4). Si un échantillon ne est pas l'une des trois espèces, les trois SNP (01073-213, 04679-157 et 10313 -052) ne parviennent pas à amplifier.

kdr génotype pour déduire la résistance aux insecticides:

Le 1014 ^ème codon d.......

Discussion

Le MDA est composé de cinq étapes principales: amplification PCR, phosphatase alcaline de crevette (SAP) réaction, vulgarisation SNP, produit d'extension conditionnement et laser assistée par matrice de désorption / ionisation - temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse ^33-37. La première étape d'amplification PCR amplifie l'ADN flanquant chaque SNP sorte que l'ADN matrice assez sera disponible à l'étape d'extension SNP. La réaction de SAP neutralise dNTP non utilisées qui peuven.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Spectrométrie			masse MALDI-TOF pour les applications génomiques afin d’analyser les acides nucléiques.
MassARRAY Nanodispenser	Sequenom	RS1000	Transfère les produits de réaction iPLEX terminés vers le SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent	Set Sequenom	10158	Réactifs utilisés pour le test iPLEX, y compris le kit SAP.

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