Génération de la RCA cellules T pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence
Summary
The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Abstract
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
Introduction
Le glioblastome (GBM) est la tumeur la plus fréquente primaire maligne au cerveau et est toujours mortelle. La résection chirurgicale couplé à la norme non-spécifique de chimiothérapie et la radiothérapie soins ne parvient pas à éliminer complètement les cellules malignes, résultant en un mauvais pronostic de moins de 15 mois chez les patients atteints de cette maladie une. En revanche, l'immunothérapie offre une approche précise pour cibler spécifiquement les cellules tumorales, et a donc le potentiel pour servir de plate-forme de traitement très efficace avec un risque réduit de garantie toxicité 2-4. Des lymphocytes T modifiés ex vivo pour exprimer des récepteurs d'antigènes chimériques (RAC) offrent une stratégie polyvalente pour l'immunothérapie des tumeurs. RAC sont produites par fusion de la région variable d'un anticorps extracellulaire avec une ou plusieurs cellules T molécule intracellulaire (s) de signalisation, au lieu d'une pleine longueur complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) -restricted récepteur de cellule T 5. Ce mode d'anticorps-antigène comme reconpermet à des cellules T spécifiques de l'antigène de réactifs reconnaissent et répondent aux antigènes de tumeur en l'absence de CMH et peuvent être adaptés pour un répertoire pratiquement infini d'antigène.
CAR cellules T modifiées contre une variété d'antigènes tumoraux ont montré l'efficacité préclinique et la promesse exceptionnelle dans la clinique 6-9. Plus précisément, dans le cadre de GBM, une variante CAR T plate-forme de ciblage cellulaire de croissance épidermique du récepteur du facteur III (EGFRvIII), une mutation spécifique de la tumeur exprimé sur la surface de la cellule 10, a été représenté à prolonger la survie chez les souris de gliome portant 11. Malgré leur polyvalence, cependant, le bénéfice clinique de la RCA thérapie adoptive n'a pas été pleinement réalisé, en partie grâce à une immunosuppression associé à une tumeur et l'évasion immunitaire 12-16 ainsi que les défis dans l'établissement et le maintien des cellules T spécifiques de l'antigène in vivo. Se appuyant sur la norme de diligence (SOC) avec une immunothérapie peut potentiellement surmonter plusieurs de ces limitations, résultant en une efficacité accrue à la fois dans la mise en préclinique et clinique.
SOC pour la post-résection GBM se compose de témozolomide à haute dose (TMZ), un agent alkylant d'ADN 17, et l'irradiation du cerveau entier (WBI) 1. Ces traitements sont présumés en synergie avec les vaccins tumorales via la régulation positive de la tumeur expression du CMH 18-20 et l'effusion d'antigènes par les cellules tumorales mortes 17,19,21,22. En effet, l'addition de TMZ 20,23 ou 18,24 WBI conduit à une amélioration efficacité antitumorale de traitements immunitaires dans la mise en préclinique. En outre, comme de nombreux agents chimiothérapeutiques cytotoxiques non-spécifiques, TMZ est connu pour causer de 25,26 lymphopénie systémique, qui peut être mis à profit comme un moyen de l'hôte conditionné pour les plateformes de thérapie adoptifs 27-29. Lymphodepletion TMZ médiée a été montré pour améliorer la fréquence et la fonction des cellules T spécifiques de l'antigène, ce qui augmente l'efficacité d'un 'adoptiontive plate-forme de traitement contre les tumeurs intracrâniennes 30. Dans le cadre de la thérapie de voitures, lymphodepletion sert de moyen de conditionnement d'hôte à la fois par la réduction du nombre de lymphocytes T suppresseurs endogène 31 et induire la prolifération homéostatique réduite 32 par compétition pour des cytokines 33, améliorant ainsi l'activité antitumorale 11,34. Étant donné la relation synergique entre GBM SOC et d'immunothérapie plates-formes, l'évaluation de nouvelles thérapies adoptifs et les plates-formes de vaccins dans le cadre du SOC est essentiel pour tirer des conclusions significatives concernant l'efficacité.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour la production et l'administration intraveineuse de cellules T spécifiques CAR-EGFRvIII murins aux côtés de TMZ et le WBI chez les souris portant des tumeurs intracrâniennes EGFRvIII-positifs (voir la figure 1 pour le traitement timeline). Brièvement, les cellules T sont versées CAR ex vivo par transduction rétrovirale. Rein embryonnaire humain (HEK) 293T cellules sont transfectées en utilisant un complexe ADN / lipide (contenant le vecteur de la RCA et plasmides PCL-Eco) pour produire un virus, qui est ensuite utilisé pour la transduction de splénocytes murins activés qui sont récoltées et cultivées en parallèle. Au cours de la génération de la RCA, les hôtes murins portant des tumeurs intracrâniennes EGFRvIII-positifs sont administrés fractionné l'ensemble du cerveau irradiation aux rayons X et le traitement systémique TMZ à des doses comparables à SOC clinique. cellules T CAR sont ensuite livrés par voie intraveineuse à des hôtes lymphodepleted.
La procédure suivante est décrite dans sept phases distinctes: (1) L'administration de témozolomide à la tumeur portant souris, (2) Le total irradiation de cerveau de souris porteuses de tumeurs, (3) la transfection, (4) La splénectomie et cellules T Préparation, (5 ) transduction, (6) Culture CAR des lymphocytes T et la récolte, et (7) l'administration de cellules T CAR à des souris porteuses de tumeurs. Ces phases se composent de plusieurs étapes qui se étendent sur 6-7 jours et sont exécutés simultanément.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le calendrier de traitement décrit ici a été conçu pour modéliser norme clinique de soins et de tirer parti de ses effets pour la RCA thérapie adoptive. T doses CAR cellulaires, schémas TMZ, et l'administration de la radiothérapie peuvent être modifiés pour améliorer l'activité in vivo des cellules T, lymphodepletion, et le meurtre de la tumeur. TMZ schémas peuvent être augmentés pour obtenir myéloablation hôte et une expansion accrue des cellules adoptive transférés 30. En…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
| 200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
| GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
| Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
| 100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
| Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
| Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
- Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
- Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
- Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
- Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
- Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
- Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
- Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
- Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
- Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
- Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
- Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
- Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
- Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
- Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
- Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
- Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
- Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
- Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
- Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
- Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
- Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
- Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
- Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
- Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
- Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
- Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
- Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
- Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
- Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
- Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
- Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
- Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).
