Generasjon av CAR T Cells for Adoptive Therapy i sammenheng med Glioblastoma Standard of Care

Summary

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Abstract

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

Introduction

Glioblastom (GBM) er den vanligste primære maligne hjernesvulst og er alltid dødelig. Kirurgisk reseksjon kombinert med ikke-spesifikk standardbehandling kjemoterapi og radioterapi unnlater å fullstendig eliminere maligne celler, noe som resulterer i en sturen prognose av mindre enn 15 måneder hos pasienter med denne sykdommen ^1. I motsetning til dette, immunterapi gir en nøyaktig tilnærming for spesifikt å målrette tumorceller, og har således potensiale til å tjene som en meget effektiv behandling plattform med redusert risiko for sikkerhet toksisitet ^2-4. T-celler konstruert ex vivo å uttrykke kimære antigen reseptorer (biler) har en allsidig strategi for svulst immunterapi. Biler blir generert ved å fusjonere det ekstracellulære variable region av et antistoff med en eller flere intracellulære T-celle signalisering molekyl (er), i stedet for en full-lengde hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) -restricted T-celle-reseptor ^5. Denne modusen av antistoff-lignende antigen anerkjennelse ogden gjør det mulig for reaktive antigen-spesifikke T-celler til å gjenkjenne og reagere på tumorantigener i fravær av MHC og kan tilpasses for et nesten uendelig antigen repertoar.

CAR T-celler utviklet mot en rekke tumorantigener har vist preklinisk effekt og enestående løftet i klinikken ^6-9. Nærmere bestemt, i sammenheng med GBM, en CAR T-celle-plattform målretting epidermal vekstfaktor-reseptor-variant III (EGFRvIII), en tumor-spesifikk mutasjon som uttrykkes på celleoverflaten ^10, ble vist å forlenge overlevelsen i glioma-bærende mus ^11. Til tross for sin allsidighet, men den kliniske nytten av CAR adoptiv terapi har ikke blitt fullt ut realisert, delvis på grunn av tumorassosiert immunsuppresjon og immununndragelser ^12-16 samt utfordringer i å etablere og opprettholde antigen-spesifikke T-celler in vivo. Utnytte standard of care (SOC) med immunterapi kan potensielt overvinne flere av disse limitasjoner, noe som resulterer i økt effekt i både preklinisk og klinisk setting.

SOC for post-reseksjon GBM består av høydose temozolomid (TMZ), en DNA alkyleringsmiddelet ^17, og hele hjernen bestråling (WBI) ^1. Disse behandlingene antas å virke synergistisk med kreftvaksiner via oppregulering av svulst MHC uttrykk ^18-20 og utgytelsen av antigener av døde kreftceller ^17,19,21,22. Faktisk tillegg av TMZ ^20,23 eller WBI ^18,24 fører til økt antitumor effekt av immunbaserte behandlinger i preklinisk innstillingen. Videre, som mange ikke-spesifikke cytotoksiske kjemoterapeutika, gis TMZ kjent for å forårsake systemisk lymfopeni ^25,26, noe som kan utnyttes som et middel til host-condition for adoptiv terapi plattformer ^27-29. TMZ-mediert lymphodepletion har vist seg å øke frekvensen og funksjon av antigen-spesifikke T-celler, noe som fører til økt effekt av en adoptive behandlingsplattform mot intrakranielle svulster ^30. I sammenheng med CAR terapi, serverer lymphodepletion som et middel til host-condition ved både å redusere antall endogene suppressor T-celler ^31, og indusere homeostatic spredning ³² via redusert konkurranse for cytokiner ^33, og dermed forsterke antitumor aktivitet ^11,34. Gitt den synergistisk forhold mellom GBM SOC og immunterapi plattformer, evaluere nye adoptiv terapier og vaksineplattformer i sammenheng med SOC er avgjørende for å trekke meningsfulle konklusjoner om effekt.

I denne protokoll har vi skissere en fremgangsmåte for generering og intravenøs administrering av murine EGFRvIII CAR-spesifikke T-celler sammen TMZ og WBI i mus som bærer EGFRvIII-positive intrakranielle tumorer (se figur 1 for behandling linjen). Kort fortalt er CAR T-celler gjort ex vivo ved retroviral transduksjon. Humane embryonale nyre (HEK) 293T-celler transfektert ved hjelp av en DNA / lipid-kompleks (som inneholder CAR vektor og PCL-Eco plasmider) for å produsere virus, som deretter brukes til å transdusere aktiverte murine splenocytter som er høstet og dyrket parallelt. I løpet av CAR generasjon, er murine verter peiling EGFRvIII-positive intrakranielle svulster administreres fraksjonert hel-hjerne røntgenbestråling og systemisk TMZ behandling ved doser sammenlign til klinisk SOC. CAR T-celler blir deretter levert intravenøst ​​til lymphodepleted verter.

Følgende fremgangsmåte er beskrevet i syv separate faser: (1) Administrasjon av Temozolomide til Tumor-bærende mus, (2) Whole Brain Bestråling av Tumor-bærende mus, (3) Transfeksjon, (4) Splenektomi og T-celle Forberedelse, (5 ) Transduksjon, (6) CAR T-celle Kultur og Harvest og (7) CAR T-celle administrasjon til Tumor-bærende mus. Disse faser består av flere trinn som går over 6-7 dager, og utføres samtidig.

Protocol

Denne protokollen er basert på en eksperimentell design hvor 10 mus behandles med 10 7 CAR-T-celler hver. Dette betyr at 10 8 CAR-T-celler vil være nødvendig; utbyttet skal være overvurdert med 5 x 10 7 -1 x 10 8 til konto for tap i levedyktighet. Følgende protokoll er skalert for å generere ca 200 x 10 6 celler. Cellene blir deretter administrert intravenøst ​​til hunn C57BL / 6-mus med 9 dagers etablerte syngeniske EGFRvIII-positive intrakranielle tumor…

Representative Results

CAR T-celler er generert av transduksjon med EGFRvIII CAR retrovirusvektoren 11. Denne vektor, MSGV1, ble utviklet fra SFGtcLuc_ITE4 vektoren 35, som inneholder det murine stamcelle virus (MSCV) lange terminale gjentagelser, den utvidede gag regionen og konvolutten spleisesete (spleisedonor, sd, og spleise-akseptor, sa), og virus emballasje signal (ψ). Den EGFRvIII CAR inneholdende det humane anti-EGFRvIII enkelt-kjede variable fragment (scFv) 139, i tandem med muse-CD8TM, CD28, 4-1BB og CD3ζ int…

Discussion

Behandlingen tidslinje som beskrives her er designet for å modellere klinisk standard for omsorg og utnytte dens virkninger for CAR adoptiv terapi. CAR T celle doser, TMZ regimer, og strålebehandling administrasjon kan bli endret for å forbedre in vivo T-celle aktivitet, lymphodepletion, og svulst drap. TMZ regimer kan økes for å gi verts myeloablasjon og økt utbygging av adoptivt overførte cellene ^30. Videre kan lymphodepletive effekter av TMZ bli rekapitulert av lav-dose (4-6 Gy) enkelt-frak…

Materials

Name of Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector	Imgenex	10045P	Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A	Sigma Aldrich	C2010	Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin	ClonTech/Takara	T100B	Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019	Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate	Life technologies	11995-065	HEK293 culture media
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life technologies	11058-021	Transfection media
200 mM L-Glutamine	Life technologies	25030-081	T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate	Life technologies	11360-070	T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life technologies	11140-050	T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol	Life technologies	21985-023	Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life technologies	15140-122	T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/mL)	Life technologies	15750-060	T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products	100-500	Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade	Gemini Bio Products	700-100P	Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10X concentrate)	BD Biosciences	555899	Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 µm Sterile Cell Strainers	Corning	352350	Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine	Corning	356469	Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Temozolomide	Best Pharmatech	N/A	Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Life Sciences	D2650	Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline	Hospira	IM 0132 (5/04)	Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl	Henry Schein Animal Health	11695-0701-1	Ketamine solution
AnaSed	Lloyd Inc	N/A	Xylazine sterile solution 100 mg/mL