Generering av CAR T-celler för adoptiv terapi som led i Glioblastoma Standard of Care
Summary
The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Abstract
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
Introduction
Glioblastom (GBM) är den vanligaste primära maligna hjärntumör och är alltid dödlig. Kirurgisk resektion i kombination med icke-specifik standardbehandling kemoterapi och strålbehandling misslyckas att helt eliminera maligna celler, vilket resulterar i en dyster prognos av mindre än 15 månader hos patienter med denna sjukdom en. Däremot erbjuder immunoterapi en exakt metod för att specifikt rikta tumörceller, och därmed har potential att fungera som en mycket effektiv behandling plattform med minskad risk för säkerheter toxicitet 2-4. T-celler konstruerade ex vivo för att uttrycka chimära antigenreceptorer (personbilar) erbjuder en mångsidig strategi för tumörimmunterapi. CARs genereras genom att smälta den extracellulära variabla regionen av en antikropp med en eller flera intracellulär T-cell signalmolekyl (s), i stället för en fullängds huvudhistokompatibilitetskomplex (MHC) -restricted T-cellsreceptor 5. Detta läge av antikroppsliknande antigen erkännande och utmärkelsepå möjliggör reaktiva antigenspecifika T-celler att känna igen och svara på tumörantigener i frånvaro av MHC och kan anpassas för en nästan oändlig antigenrepertoar.
CAR-T-celler manipulerade mot en mängd olika tumörantigener har visat effekt i djurstudier och enastående löfte i kliniken 6-9. Specifikt inom ramen för GBM, en CAR T-cell-plattform riktar epidermal tillväxtfaktorreceptor variant III (EGFRvIII), en tumörspecifik mutation uttrycks på cellytan 10, visade sig förlänga överlevnaden i gliom bärande möss 11. Trots sin mångsidighet dock den kliniska nyttan av CAR adoptiv terapi har inte fullt ut, delvis beroende på tumörassocierad immunsuppression och immun skatteflykt 12-16 samt utmaningar i att etablera och upprätthålla antigenspecifika T-celler in vivo. Utnyttja standardbehandling (SOC) med immunterapi kan potentiellt övervinna flera av dessa limitationer, vilket resulterar i förbättrad effektivitet i både preklinisk och klinisk miljö.
SOC för post-resektion GBM består av högdos temozolomid (TMZ), ett DNA-alkyleringsmedel 17, och hela hjärnan bestrålning (WBI) 1. Dessa behandlingar antas samverka med tumörvacciner via uppreglering av tumör MHC uttryck 18-20 och avgivande av antigener från döda tumörceller 17,19,21,22. Faktum tillägg av TMZ 20,23 eller WBI 18,24 leder till förbättrad antitumör effekten av immunbaserade behandlingar i preklinisk miljö. Vidare, i likhet med många icke-specifika cytotoxiska kemoterapeutika, TMZ känt för att orsaka systemisk lymfopeni 25,26, som kan utnyttjas som ett sätt att värd-konditionering för adoptiv terapi plattformar 27-29. TMZ-medierad lymphodepletion har visats öka frekvensen och funktion av antigenspecifika T-celler, vilket leder till ökad effektivitet hos en adoptiva terapi plattform mot intrakraniella tumörer 30. I samband med CAR terapi, tjänar lymphodepletion som ett sätt att värdkonditione både minska antalet endogena suppressor T-celler 31, och förmå homeostatiska proliferation 32 via minskad konkurrens om cytokiner 33, och därmed stärka antitumöraktivitet 11,34. Med tanke på den synergistiska förhållandet mellan GBM SOC och immunterapi plattformar, utvärdera nya adoptivföräldrar terapier och vaccinplattformar inom ramen för SOC är avgörande för att dra meningsfulla slutsatser om effekten.
I detta protokoll vi beskriva en metod för generering och intravenös administrering av murina EGFRvIII specifika CAR T-celler vid sidan TMZ och WBI i möss med EGFRvIII-positiva intrakraniella tumörer (se figur 1 för behandling tidslinje). I korthet är CAR T-celler görs ex vivo genom retroviral transduktion. Humana embryonala njur (HEK) 293T-celler transfekteras med användning av en DNA / lipidkomplex (innehållande CAR vektorn och PCL-Eco-plasmider) för att producera virus, som sedan används för att transducera aktiverade murina splenocyter som skördas och odlade parallellt. Under CAR generation, är murina värdar bär EGFRvIII-positiva intrakraniella tumörer administrerade fraktion hela hjärnan röntgenstrålning och systemisk TMZ behandling vid doser jämförbara med den kliniska SOC. CAR T-celler levereras sedan intravenöst till lymphodepleted värdar.
Följande procedur beskrivs i sju separata faser: (1) Administration av Temozolomide till tumörbärande möss, (2) Hela Brain Bestrålning av tumörbärande möss, (3) Transfektion, (4) Splenektomi och T-cell Förberedelse, (5 ) Transduktion, (6) CAR T-cell kultur och skörd, och (7) celladministrerings CAR T till tumörbärande möss. Dessa faser består av flera steg som spänner 6-7 dagar och utförs samtidigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Behandlingen tidslinje beskrivs här var utformad för att modellera den kliniska standardbehandling och utnyttja dess effekter för CAR adoptiv terapi. CAR T celldoser, TMZ regimer och strålbehandling administrering kan modifieras för att öka in vivo T-cellaktivitet, lymphodepletion, och tumördödande. TMZ regimer kan ökas för att ge värd myeloablation och ökad expansion av adoptivt överförda celler 30. Dessutom kan de lymphodepletive effekterna av TMZ vara rekapituleras med låg dos (4-6 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
| 200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
| GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
| Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
| 100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
| Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
| Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
- Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
- Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
- Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
- Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
- Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
- Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
- Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
- Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
- Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
- Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
- Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
- Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
- Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
- Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
- Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
- Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
- Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
- Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
- Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
- Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
- Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
- Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
- Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
- Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
- Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
- Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
- Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
- Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
- Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
- Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
- Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
- Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).
