एक छोटे oligomer के गठन झिल्ली प्रोटीन की अवसादन संतुलन: Pentameric स्थिरता पर Histidine Protonation का प्रभाव
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
विश्लेषणात्मक ultracentrifugation (नीलामी) बातचीत ताकत की एक विस्तृत श्रृंखला से अधिक है और शारीरिक शर्तों के तहत बड़े अणुओं के बीच प्रतिवर्ती बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस नीलामी मात्रात्मक stoichiometry और homo- और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में क्षणिक और प्रतिवर्ती हैं कि असमलैंगिक एसोसिएशन की ऊष्मा का आकलन करने के लिए विकल्प की एक विधि बनाता है। अवसादन संतुलन के साधन (एसई) में, प्रसार और अवसादन के बीच एक संतुलन एक विशिष्ट एसोसिएशन मॉडल पर निर्भर करता है कि रेडियल दूरी के एक समारोह के रूप में एक प्रोफाइल प्रदान करता है। इस के साथ साथ, एक विस्तृत एसई प्रोटोकॉल एक विश्लेषणात्मक ultracentrifuge का उपयोग कर एक छोटी सी झिल्ली प्रोटीन oligomer के आकार और मोनोमर-मोनोमर एसोसिएशन ऊर्जा निर्धारित करने के लिए वर्णित है। नीलामी-ते केवल भौतिक सिद्धांतों पर आधारित है, लेबल से मुक्त है, और दोनों पानी में घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन पर इस्तेमाल किया जा सकता है। एक उदाहरण के उत्तरार्द्ध से दिखाया गया है, मानव श्वसन syncytial वायरस में छोटे हाइड्रोफोबिक (एसएच) प्रोटीन (hRSV), Pentameric आयन चैनल है कि रूपों एक एकल α-पेचदार ट्रांसमेम्ब्रेन (टीएम) डोमेन के साथ एक 65 एमिनो एसिड पॉलीपेप्टाइड। एनएमआर आधारित संरचनात्मक डेटा एसएच प्रोटीन चैनल के लुमेन का सामना करना पड़ उन्मुख होते हैं कि अपने ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन protonatable दो उनके अवशेषों को पता चलता है कि। एसई प्रयोगों पीएच एसोसिएशन निरंतर और एसएच प्रोटीन की oligomeric आकार को प्रभावित करता है कि कैसे निर्धारित करने के लिए डिजाइन किया गया है। Pentameric फार्म सभी मामलों में संरक्षित किया गया था, वहीं अपने सहयोग निरंतर कम पीएच पर कम हो गया था। इन आंकड़ों एसएच प्रोटीन में दो उनके अवशेषों की एक lumenal उन्मुखीकरण के साथ संगत एसएच चैनल गतिविधि के लिए मनाया एक समान पीएच निर्भरता, साथ समझौते में हैं। उत्तरार्द्ध कम पीएच पर इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण और कम oligomer स्थिरता अनुभव हो सकता है। शारीरिक स्थितियों में सूक्ष्म प्रोटीन, प्रोटीन एसोसिएशन परिवर्तन पर मात्रात्मक जानकारी मापा जा करने के लिए है, जब भी सारांश में, इस पद्धति लागू है।
Introduction
विश्लेषणात्मक ultracentrifugation 1-5, शारीरिक शर्तों के तहत बड़े अणुओं की बातचीत का अध्ययन कमजोर और मजबूत बातचीत दोनों के लिए सुलभ होने के लिए सबसे महत्वपूर्ण तरीकों में से एक है। विधि लेबल से मुक्त है और प्रकाश अवशोषण या हस्तक्षेप का उपयोग करता है, और यहां तक कि प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल प्रणाली परिमाण 6 के कई आदेशों से अधिक एकाग्रता पर्वतमाला का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
सबसे जैव रासायनिक प्रक्रियाओं प्रतिवर्ती बातचीत पर निर्भर करती है, क्योंकि इस पद्धति का विशेष रूप से उपयोगी है। इन मुलाकातों के stoichiometry और ताकत मात्रात्मक जैविक प्रक्रियाओं को समझने की विशेषता किया जाना है, और तरीकों की एक संख्या में इस उद्देश्य के 7, 8 के लिए मौजूद हैं। हालांकि, क्षणिक बातचीत 9 अध्ययन करने के लिए मुश्किल हैं।
macromolecular बातचीत चिह्नित करने के लिए एक विधि के चुनाव को अपनी स्थिर या गतिशील प्रकृति पर निर्भर करता है। पहले मामले में, sedim entation वेग (एसवी) रेडियल परिवहन की दर को मापा जाता है और परिसरों प्रसन्नचित्त द्रव्यमान और आकार में अंतर के आधार पर fractionated कर रहे हैं, प्रयोग किया जाता है।
इसके विपरीत, प्रयोग के समय के पैमाने पर प्रतिवर्ती हैं कि गतिशील संघों शारीरिक रूप से अलग नहीं किया जा सकता है। इस मामले में, स्वयं या गैर सहसंयोजक बातचीत के लिए अग्रणी असमलैंगिक बातचीत कुल प्रोटीन एकाग्रता पर निर्भर करता है कि एक संतुलन में हैं। ये गतिशील बातचीत अवसादन संतुलन (एसई) और अवसादन वेग (एसवी) 10 दोनों द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। हालांकि, पहली विधि के प्रदर्शन करने के लिए सरल है और यहाँ वर्णित है। एक संतुलन प्रसार और अवसादन के बीच तक पहुँच जाता है इतना है कि असल में, centrifugation के एक पर्याप्त रूप से कम गति से किया जाता है। इस बिंदु पर, रेडियल दूरी के एक समारोह के रूप में एक ऑप्टिकल संकेत (यूवी तुलना) का संतुलन प्रोफाइल, संघों 11 के लिए पूर्व निर्धारित thermodynamic के मॉडल का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है।
ve_content "> वर्तमान पत्र में, एक अवसादन संतुलन अध्ययन की वजह से अपनी hydrophobicity की। आयन चैनल है कि रूपों एक वायरल झिल्ली प्रोटीन की स्वयं संघ के समक्ष प्रस्तुत किया है, प्रयोग डिटर्जेंट की मौजूदगी में चलाने के लिए, और इस मामले में घनत्व की है विलायक डिटर्जेंट की है कि करने के लिए मिलान किया जाना है। हालांकि, प्रोटोकॉल कोई विलायक घनत्व मिलान की आवश्यकता होगी, सिवाय इसके कि एक पानी में घुलनशील प्रोटीन के मामले में होगा समान वर्णित है।इस्तेमाल किया प्रोटीन मानव श्वसन syncytial वायरस (hRSV), कम श्वसन तंत्र शिशुओं में रोग, बुजुर्ग और प्रतिरक्षा अक्षमता आबादी दुनिया भर में 12 का कारण बनता है कि paramyxoviridae परिवार में एक छा pneumovirus में इनकोडिंग है। HRSV संक्रमण के ऊपर से 64 लाख मामलों की रिपोर्ट और 160,000 से होने वाली मौतों के लिए हर साल होते हैं।
hRSV जीनोम तीन झिल्ली प्रोटीन एफ, जी, और छोटे हाइड्रोफोबिक (एसएच) सहित 11 प्रोटीन, transcribes। एसएच प्रोटीन शामिल हैआरएसवी संक्रमण के रोगजनन में। एसएच जीन (RSVΔSH) की कमी आरएसवी, व्यवहार्य था syncytia के गठन के कारण होता है और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) वायरस 13-16 के रूप में भी वृद्धि हुई। हालांकि, RSVΔSH वायरस ऊपरी श्वास पथ 15, 16 में गुम्मट से भी कम कुशलता से 10 गुना दोहराया। इसके अलावा, RSVΔSH वायरस विवो माउस और चिंपांज़ी मॉडल 13, 17 में में तनु था।
एसएच प्रोटीन एक 64 (आरएसवी उपसमूह ए) या 65 (आरएसवी उपसमूह बी) अमीनो एसिड लंबे प्रकार गोल्गी कम्पार्टमेंट 18 की झिल्लियों पर ज्यादातर जम जाता है कि द्वितीय अभिन्न झिल्ली प्रोटीन होता है। एसएच प्रोटीन एक भी अत्यधिक 20,21 संरक्षित है, जो एक-पेचदार ट्रांसमेम्ब्रेन (टीएम) डोमेन 19 की भविष्यवाणी की है। सी और एन टर्मिनल extramembrane डोमेन के lumenally / extracellularly और cytoplasmically, क्रमशः उन्मुख होते हैं।
दोनों सिंथेटिक टीएम डोमेन (अवशेषों 18-43) और पूरी लंबाई एसएच प्रोटीन डिटर्जेंट की एक किस्म में homopentamers फार्म करने के लिए दिखाया गया है। homopentameric फार्म तलीय लिपिड bilayers 22,23 में चैनल गतिविधि के लिए जिम्मेदार है। लिपिड bilayer में टीएम monomers के सही ओरिएंटेशन पहले उनकी -22, एक lumenal में होना करीब अभिविन्यास, इंटर-पेचदार करने के लिए जो दिखाया साइट विशिष्ट अवरक्त Dichroism 23 का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। एक ही टीएम डोमेन अभिविन्यास (डीपीसी) dodecylphosphocholine में pentameric पूर्ण लंबाई प्रोटीन का एक-पेचदार बंडल खंगाला 22 micelles कि एनएमआर अध्ययन से इसकी पुष्टि की गई थी। इस 'मिसेल' मॉडल में, एक भी एक- पेचदार टीएम डोमेन एक विस्तारित बी-बाल के लिये कांटा द्वारा सी-टर्मिनली एक एक-हेलिक्स द्वारा एन टर्मिनली flanked, और किया गया था। एसएच प्रोटीन के दो protonatable अवशेष, उनकी -22 और उनका-51, टीएम डोमेन (lumenally उन्मुख) में स्थित हैं, और extramembrane सी टर्मिनल β बाल के लिये कांटा की नोक पर क्रमश: (दूर चैनल ताकना से)। एक bicellar enviro मेंnment, तथापि, टीएम α-हेलिक्स उनका-51 तक फैली है, और अपने दोनों अवशेषों चैनल 24 के लुमेन के लिए पहुंच रहे हैं। 22 हाइड्रोफोबिक पक्ष श्रृंखला (इले-32, इले-36, इले-40 और लियू-44), और साथ तैयार है चैनल संरचना एक कीप की तरह वास्तुकला 22, जहां संकरा क्षेत्र को गोद ले (Cys-45 सर्विसेज-29 के लिए) इले-36 चैनल लुमेन में सबसेसंकरेमें बिंदु को परिभाषित करता है। उनका-51 छोटी से छोटी खोलने की नोक पर है जबकि उनकी -22, यह कीप का सबसे बड़ा उद्घाटन के अवसर पर स्थित है।
वर्तमान में कागज, एक अवसादन संतुलन मोड में विश्लेषणात्मक centrifugation के उनके protonation एसएच प्रोटीन pentamer की स्थिरता को प्रभावित करता है, तो यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस मामले में, एसएच प्रोटीन कि एसएच प्रोटीन रूपों pentameric oligomers 22 को दिखाने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है जो C14-betaine डिटर्जेंट, में solubilized गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र नमूना तैयार करने और संतुलन अवसादन का उपयोग कर डिटर्जेंट में एक छोटी सी झिल्ली प्रोटीन की oligomerization के विश्लेषण के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। घनत्व मिलान चरण आवश्यक नहीं है के रू?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. . Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions – Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- . . An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. . Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
