Sedimentation Ligevægt af en lille Oligomer-dannende Membrane Protein: Effekt af histidin Protonering på pentamert Stabilitet
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
Analytisk ultracentrifugering (AUC) kan bruges til at studere reversible vekselvirkninger mellem makromolekyler over et bredt område af interaktion styrker og under fysiologiske betingelser. Dette gør AUC et foretrukne metode til kvantitativ vurdering støkiometri og termodynamik homo- og hetero-forening, der er forbigående og reversible i biokemiske processer. I modalitet af sedimentation ligevægt (SE), en balance mellem diffusion og sedimentation giver en profil som funktion af radial afstand, der afhænger af en specifik association model. Heri er en detaljeret SE beskrevne protokol til at bestemme størrelsen og monomer-monomer association energi af en lille membranprotein oligomer ved hjælp af en analytisk ultracentrifuge. AUC-ES er label-fri, kun er baseret på fysiske principper, og kan bruges på begge vandopløselige og membranproteiner. Et eksempel er vist på sidstnævnte, den lille hydrofob (SH) protein i humant respiratorisk syncytialvirus (HRSV), En 65-aminosyre polypeptid med en enkelt α-helical transmembrane (TM) domæne, som danner pentamere ionkanaler. NMR-baserede strukturelle data viser, at SH protein har to protonerbar His-rester i dens transmembrane domæne, der er orienteret overfor lumen af kanalen. SE eksperimenter er designet til at bestemme, hvordan pH påvirker associationskonstant og oligomere størrelse SH protein. Mens den pentamere form, blev bevaret i alle tilfælde var dens forening konstant reduceret ved lav pH. Disse data er i overensstemmelse med en lignende pH-afhængighed observeret for SH-kanal aktivitet i overensstemmelse med en lumenale orientering af de to Hans rester i SH protein. Sidstnævnte kan opleve elektrostatiske frastødning og reduceret oligomer stabilitet ved lav pH. Sammenfattende denne metode anvendes, når kvantitative oplysninger om subtile protein-protein forening ændringer i fysiologiske betingelser skal måles.
Introduction
Analytisk ultracentrifugering 1-5 er en af de vigtigste metoder til at studere interaktioner af makromolekyler under fysiologiske betingelser, at være tilgængelige for både svage og stærke vekselvirkninger. Metoden er mærket-fri og bruger lys absorption eller indblanding, og selv fluorescens optiske systemer kan bruges til at få adgang koncentrationsintervaller over flere størrelsesordener 6.
Denne metode er især nyttig, da de fleste biokemiske processer afhænger vendbare interaktioner. Støkiometrien og styrken af disse interaktioner skal kvantitativt at forstå biologiske processer, og en række metoder til at dette formål 7, 8. Det er imidlertid vanskeligt at studere 9 forbigående interaktioner.
Valget af en metode til at karakterisere makromolekylære interaktioner afhænger af dens statisk eller dynamisk karakter. I det første tilfælde sedim entation hastighed (SV) anvendes, hvor hastigheden af radial transport måles og komplekser fraktioneret på baggrund af forskelle i stigende masse og form.
I modsætning hertil dynamiske forbund, som er reversibel på tidsskalaen af eksperimentet ikke kan adskilles fysisk. I dette tilfælde, selv- eller hetero-interaktioner, der fører til ikke-kovalente interaktioner i en ligevægt, der afhænger af den totale proteinkoncentration. Disse dynamiske vekselvirkninger kan studeres både sedimentation ligevægt (SE) og sedimentation hastighed (SV) 10. Men den første metode er enklere at udføre og er beskrevet her. I SE er centrifugering udføres ved en tilstrækkelig lav hastighed, så en ligevægt mellem diffusion og sedimentation. På dette tidspunkt ligevægt profil af et optisk signal (UV-VIS) som en funktion af radial afstand, kan analyseres ved anvendelse af forudindstillede termodynamiske modeller for foreninger 11.
ve_content "> I det foreliggende papir, en sedimentation ligevægt undersøgelse præsenteres i association af et viralt membranprotein, der danner ionkanaler. På grund af dets hydrofobicitet, er forsøget køre i nærvær af detergent, og i dette tilfælde densitet Opløsningsmidlet skal matches med den detergent. Men protokollen beskrevet ville identisk i tilfælde af et vandopløseligt protein, bortset fra, at ingen tilsvarende tæthed opløsningsmiddel ville være påkrævet.Det anvendte protein er kodet i human respiratorisk syncytialvirus (HRSV), et kappebærende pneumovirus i Paramyxoviridae-familien, der forårsager nedre luftveje hos spædbørn, ældre og immunkompromitterede populationer verdensplan 12. Op til 64 millioner rapporterede tilfælde af HRSV-infektion og 160.000 dødsfald hvert år.
HRSV genomet transkriberer 11 proteiner, herunder de tre membranproteiner F, G og små hydrofobe (SH). SH protein er involvereti patogenesen af RSV-infektion. RSV mangler SH genet (RSVΔSH) var levedygtige, forårsagede dannelsen af syncytia og voksede samt vildtype (WT) virus 13-16. RSVΔSH virus replikerede imidlertid 10 gange mindre effektivt end WT i de øvre luftveje 15, 16. Også blev RSVΔSH virus svækket i in vivo mus og chimpanse modeller 13, 17.
SH-proteinet er en 64 (RSV undergruppe A) eller 65 (RSV undergruppe B) aminosyrer lange type II integreret membranprotein, der akkumulerer hovedsagelig på membraner i Golgi kammer 18. SH protein har en enkelt forudsagt a-spiralformet transmembran (TM) domæne 19, som er stærkt bevaret 20,21. C- og N-terminale extramembrane domæner er orienteret lumenally / ekstracellulært og cytoplasmatisk hhv.
Både syntetiske TM domæne (resterne 18-43) Og fuld længde SH protein har vist sig at danne homopentamers i en række forskellige detergenter. Den homopentameric formular er ansvarlig for kanal aktivitet i plane lipiddobbeltlag 22,23. Den korrekte orientering af TM monomerer i lipiddobbeltlaget blev først bestemt ved hjælp af stedspecifik infrarød dichroisme 23, som viste His-22 for at være i en luminale tæt på inter-spiralformet orientering. Den samme TM domæne orientering blev bekræftet ved NMR-undersøgelser, der rekonstrueret pentamere a-spiralformet bundt af fuld-længde protein i dodecylphosphocholine (DPC) miceller 22. I denne "micelle" model, blev en enkelt a- spiralformet TM domæne flankeret N-terminalt af en a-helix, og C-terminalt af en udvidet b-hårnål. De to protonerbar rester af SH protein, His-22 og His-51, er placeret i TM-domænet (lumenally orienteret) og ved spidsen af extramembrane C-terminal β hårnål (langt fra kanalen pore) hhv. I en bicellar environment imidlertid TM α-helix strækker sig op til His-51, og begge His-rester er tilgængelige for lumen kanal 24. Kanalen struktur vedtager en tragt-lignende arkitektur 22, hvor det smallere område (Ser-29 til Cys-45) 22 er foret med hydrofobe sidekæder (Ile-32, Ile-36, Ile-40 og Leu-44), og Ile-36 definerer det smalleste sted i kanalen lumen. His-22 er placeret på den største åbning af denne tragt, hvorimod His-51 på spidsen af den mindste åbning.
I det foreliggende papir, er analytisk centrifugering i en sedimentation ligevægt tilstand blevet anvendt til at afgøre, om hans protonering påvirker stabiliteten af SH protein pentamer. I dette tilfælde blev SH protein opløst i C14-betain detergent, som er blevet anvendt tidligere for at vise, at SH protein former pentamere oligomerer 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir giver en forsøgsprotokol til forberedelse og analyse af oligomerisering af en lille membran protein i vaskemiddel hjælp ligevægt sedimentering prøve. Den beskrevne protokol gælder også -og simpler- for opløselige proteiner, som tætheden matching skridt ikke er påkrævet. Faktisk er systemet udgøres af en blanding af rengøringsmiddel og protein. At gennemføre sedimentering undersøgelser, skal vaskemiddel være usynlig for tyngdefeltet, så det ikke bidrager til partiklen flotation. Således densi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. . Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions – Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- . . An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. . Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
