Sedimentationsgleichgewicht eines Klein Oligomer bildenden Membrane Protein: Wirkung von Histidin Protonierung auf pentamere Stabilität
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
Analytische Ultrazentrifugation (AUC) kann verwendet werden, um reversible Wechselwirkungen zwischen Makromolekülen über einen weiten Bereich von Wechselwirkungsstärken und unter physiologischen Bedingungen untersucht werden. Dies macht AUC eine Methode der Wahl die quantitative Erfassung Stöchiometrie und Thermodynamik von Homo- und Hetero-Vereinigung, die vorübergehende und reversible in biochemischen Prozessen sind. In der Modalität Sedimentationsgleichgewichts (SE), ein Gleichgewicht zwischen Diffusion und Sedimentation ein Profil als eine Funktion der radialen Distanz, die an einem bestimmten Assoziationsmodell abhängt. Hierin wird eine detaillierte SE Protokoll beschrieben, um die Größe und die Monomer-Monomer-Assoziationsenergie eines kleinen Membranprotein-Oligomer mittels einer analytischen Ultrazentrifuge bestimmen. AUC-ES ist markierungsfreie, nur auf physikalischen Prinzipien beruhen, und kann auf beiden wasserlöslich und Membranproteinen verwendet werden. Ein Beispiel des letzteren gezeigt ist, die kleinen hydrophoben (SH) Protein im menschlichen Respiratory Syncytial Virus (HRSV), Ein 65-Aminosäuren-Polypeptid mit einer einzigen α-Helix-Transmembran (TM), die gegen pentamere Ionenkanäle bildet. NMR basierenden Strukturdaten zeigt, daß SH-Protein hat zwei protonierbare His-Resten in seiner Transmembrandomäne, die dem Lumen zugewandt orientiert des Kanals. SE-Experimente wurden entworfen, um festzustellen, wie pH Assoziationskonstante und die oligomere Größe SH Proteins beeinflusst. Während die pentameren Form wurde in allen Fällen erhalten, wurde sein Assoziationskonstante bei niedrigen pH reduziert. Diese Daten sind in Übereinstimmung mit einem ähnlichen pH-Abhängigkeit für SH Kanalaktivität beobachtet, die mit einer Lumen Orientierung der beiden His-Reste in SH-Protein. Letztere können die elektrostatische Abstoßung und reduziert Oligomer Stabilität bei niedrigen pH zu erleben. Zusammenfassend ist das Verfahren anwendbar, wenn die quantitative Informationen über feine Assoziation von Proteinen Veränderungen in physiologischen Bedingungen gemessen werden.
Introduction
Analytische Ultrazentrifugation 1-5 ist eine der wichtigsten Methoden, um Wechselwirkungen von Makromolekülen, die unter physiologischen Bedingungen zu studieren, zugänglich sowohl schwache und starke Wechselwirkung. Die Methode ist markierungsfreie und nutzt Lichtabsorption oder Störungen und sogar Fluoreszenz optische Systeme verwendet werden, um Konzentrationsbereiche über mehrere Größenordnungen 6 zuzugreifen.
Dieses Verfahren ist besonders nützlich, da die meisten biochemischen Prozessen abhängen reversible Interaktionen. Die Stöchiometrie und die Stärke dieser Wechselwirkungen müssen quantitativ charakterisiert, um biologische Prozesse zu verstehen, und eine Reihe von Methoden für diesen Zweck 7, 8 vorhanden sind. Allerdings sind vorübergehende Wechselwirkungen schwer zu untersuchen 9.
Die Wahl eines Verfahrens zur makromolekularen Wechselwirkungen charakterisieren hängt von seiner statischen oder dynamischen Natur. Im ersten Fall, SEDIM entation Geschwindigkeit (SV) verwendet wird, wobei die Rate der radialen Transport gemessen und Komplexe werden auf der Grundlage von Unterschieden in Auftriebs Masse und Form fraktioniert.
Im Gegensatz dazu können dynamische Verbände, die auf der Zeitskala des Experiments reversible nicht physisch getrennt sein. In diesem Fall kann selbst- oder hetero-Wechselwirkungen, die zu nicht-kovalente Wechselwirkungen in einem Gleichgewicht stehen, die auf der Gesamtproteinkonzentration abhängt. Diese dynamischen Wechselwirkungen kann sowohl Sedimentationsgleichgewicht (SE) und Sedimentation Geschwindigkeit (SV) 10 untersucht werden. Jedoch ist das erste Verfahren einfacher durchzuführen, und wird hier beschrieben. In SE wird eine Zentrifugation bei einer ausreichend niedrigen Geschwindigkeit durchgeführt, so dass ein Gleichgewicht zwischen Diffusion und Sedimentation erreicht. An diesem Punkt wird das Gleichgewichtsprofil eines optischen Signals (UV-VIS) als eine Funktion des radialen Abstands, können mit vorgegebenen thermodynamischen Modellen für Verbände 11 analysiert werden.
ve_content "> In der vorliegenden Arbeit wird eine Sedimentationsgleichgewichts Untersuchung der Selbstassoziation von einem viralen Membranprotein, Ionenkanäle bildet. Aufgrund ihrer Hydrophobizität präsentiert wird das Experiment in Gegenwart eines Detergens ausgeführt wird, und in diesem Fall die Dichte Lösungsmittel auf, dass der Reinigungsmittel abgestimmt werden. Das beschriebene Protokoll würde im Falle eines wasserlöslichen Proteins identisch ist, außer daß kein Lösungsmittel Dichteanpassung erforderlich wäre.Das verwendete Protein ist in der menschlichen Respiratory Syncytial Virus (HRSV), ein umhülltes Pneumovirus der Paramyxoviridae Familie, die Erkrankung der unteren Atemwege bei Säuglingen und älteren Menschen immun Populationen weltweit 12 bewirkt kodiert. Bis zu 64 Millionen Fälle von HRSV Infektion und 160.000 Todesfälle pro Jahr.
HRSV Genom transkribiert 11 Proteinen, einschließlich der drei Membranproteine F, G und kleine hydrophobe (SH). SH-Proteins beteiligt istbei der Pathogenese von RSV-Infektion. RSV fehlt das SH-Gen (RSVΔSH) war lebensfähig, verursacht die Bildung von Syncytien und wuchs als auch der Wildtyp (WT) Virus 13-16. Jedoch repliziert RSVΔSH Virus 10-mal weniger wirksam als das WT in den oberen Atemwegen 15, 16. Außerdem wurde RSVΔSH Virus in in vivo-Maus und Schimpansen Modelle 13, 17 gedämpft.
Der SH-Protein ist ein 64 (RSV Untergruppe A) oder 65 (RSV Untergruppe B) Aminosäuren lang Typ II integrales Membranprotein, die meist an den Membranen des Golgi-Kompartiment 18 ansammelt. SH-Protein hat eine einzige sagte eine Helix-Transmembran (TM) Domäne 19, die hoch konserviert ist 20,21. Die C- und N-terminalen Domänen extramembranären lumenally / extrazellulär cytoplasmatisch, jeweils ausgerichtet sind.
Sowohl synthetische TM-Domäne (Reste 18-43) Und in voller Länge SH Protein wurde gezeigt, dass homopentamers in einer Vielzahl von Reinigungsmitteln zu bilden. Die homopentameric Form ist für die Kanalaktivität in planaren Lipid-Doppelschichten 22,23 verantwortlich. Die korrekte Orientierung der TM-Monomeren in der Lipiddoppelschicht wurde zuerst bestimmt unter Verwendung von ortsspezifischen Infrarot-Dichroismus 23, die zeigten, His-22 in einer luminalen Seite nahe inter-helikalen, Orientierung. Das gleiche TM Domänenorientierung wurde durch NMR-Untersuchungen, die pentameren eine -helikale Bündel des gesamten Proteins in Dodecylphosphocholin (DPC) rekonstruiert Micellen 22 bestätigt. In diesem Modell "Mizelle", ein einzelnes a- helikalen Transmembrandomäne wurde N-terminal durch eine a-Helix durch eine erweiterte b-Hairpin flankiert, und C-terminal. Die beiden protonierbaren Reste von SH-Protein, His-22 und His-51, sind in der TM-Domäne (lumenally orientiert) angeordnet ist, und an der Spitze des extramembranären C-terminalen β Hairpins (vom Kanalpore) sind. In einem bicellar environment erstreckt sich jedoch das TM α-Helix bis His-51, und beide His-Resten zugänglich dem Lumen des Kanals 24 sind. Die Kanalstruktur nimmt eine trichterartige Architektur 22, wobei der engere Bereich (Ser-29 bis Cys-45) 22 ist mit hydrophoben Seitenketten (Ile-32 Ile-36 Ile-40 und Leu-44) und ausgekleidet Ile-36 ist der engsten Stelle in der Kanal Lumen. His-22 mit der größten Öffnung des Trichters, während His-51 ist an der Spitze der kleinsten Öffnung.
In der vorliegenden Arbeit, analytischen Zentrifugation in einer Sedimentationsgleichgewicht Modus verwendet wurde, um festzustellen, ob seine Protonierung die Stabilität des SH-Protein Pentamer betrifft. In diesem Fall wurde SH-Protein in C14-Betain-Wasch, die zuvor verwendet wurde, um die sh Proteinformen pentameren Oligomere 22 zeigen solubilisiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Dokument enthält eine experimentelle Protokoll für die Probenvorbereitung und Analyse von Oligomerisierung von einem kleinen Membranprotein in Waschmittel mit Gleichgewicht Sedimentation. Das beschriebene Protokoll ist gleichermaßen gültig -und simpler- für lösliche Proteine, wie die Dichte Anpassungsschritt nicht erforderlich ist. Tatsächlich wird das System durch ein Gemisch aus Reinigungsmittel und Protein gebildet ist. Um Sedimentation Studien durchzuführen, muss das Reinigungsmittel unsichtbar für d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
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