שקיעת שיווי משקל של חלבון ממברנה הקטן oligomer יוצרי: אפקט של היסטידין protonation על pentameric יציבות
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
ultracentrifugation אנליטית (AUC) יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות הפיכים בין מקרו-מולקולות על פני טווח רחב של עוצמות אינטראקציה ובתנאים פיסיולוגיים. זה עושה AUC שיטת הבחירה להעריך stoichiometry ותרמודינאמיקה של הומו והטרו-עמותה שחולפות והפיכים בתהליכים ביוכימיים כמותית. באופנות של שיווי משקל שקיעה (SE), איזון בין דיפוזיה והשקיעה מספק פרופיל כפונקציה של מרחק הרדיאלי שתלויה בדגם ספציפי עמותה. במסמך זה, פרוטוקול SE מפורט מתואר כדי לקבוע את אנרגיית קשר הגודל ומונומר-מונומר של oligomer חלבון קרום קטן באמצעות ultracentrifuge אנליטיים. AUC-ES הוא ללא תווית, המבוסס רק על עקרונות פיזיים, וניתן להשתמש בו בשני חלבונים מסיסים וקרום המים. דוגמא מוצגת של האחרון, החלבון הקטן הידרופובי (SH) בוירוס syncytial נשימה האנושי (hRSV), פוליפפטיד חומצת אמינו עם 65-תחום α-סליל יחיד הטרנסממברני (TM) שיוצר תעלות יונים pentameric. נתונים מבניים המבוססים על NMR מראה כי חלבון SH שתי protonatable השאריות שלו בתחום הטרנסממברני שמכוונים מול לומן של הערוץ. ניסויי SE תוכננו כדי לקבוע כיצד pH משפיע קבוע עמותה וגודל oligomeric חלבון SH של. בעוד שצורת pentameric נשמרה בכל המקרים, קבוע הקשר שלה הופחת ב- pH הנמוך. נתונים אלה הם בהסכם עם תלות דומה pH נצפתה לפעילות ערוץ SH, עולה בקנה אחד עם נטייה lumenal של שתי השאריות שלו בחלבון SH. האחרונים עשויים לחוות דחייה אלקטרוסטטית ויציבות oligomer מופחתת ב- pH הנמוך. לסיכום, שיטה זו ישימה בכל פעם שמידע כמותי על עדינים חלבונים שינויי עמותה בתנאים פיסיולוגיים צריכה להימדד.
Introduction
ultracentrifugation אנליטית 1-5 הוא אחת מהשיטות החשובות ביותר ללמוד אינטראקציות של מקרו-מולקולות בתנאים פיסיולוגיים, להיות נגיש לשני אינטראקציות חלשות וחזקות. השיטה היא ללא תווית ומשתמשת קליטה או הפרעות של אור, והוא יכול לשמש גם מערכות אופטיות הקרינה לגשת טווחי ריכוז על פני כמה סדרי הגודל 6.
שיטה זו שימושית במיוחד מכיוון שרוב התהליכים ביוכימיים תלויים באינטראקציות הפיכה. Stoichiometry ועוצמתו של אינטראקציות אלה צריכים להיות מאופיינים כמותית להבין תהליכים ביולוגיים, ומספר השיטות קיים למטרה זו 7, 8. עם זאת, אינטראקציות חולפות קשות ללמוד 9.
הבחירה של שיטה לאפיון אינטראקציות macromolecular תלויה באופי סטטי או הדינמי שלה. במקרה הראשון, sedim entation מהירות (SV) משמשת, שבה השיעור של תחבורת רדיאלי נמדד ומתחמים הם מופרדים על בסיס ההבדלים במסה ובצורה קלילה.
בניגוד לכך, עמותות דינמיות שהן הפיכים בקנה המידה של הניסוי הזמן לא ניתן להפריד באופן פיזי. במקרה זה, עצמי או הטרו-אינטראקציות מובילות לאינטראקציות שאינן קוולנטיים נמצאות בשיווי משקל זה תלוי בסך הכל ריכוז החלבון. ניתן ללמוד אינטראקציות דינמיות אלה על ידי שני שיווי משקל שקיעה (SE) ומהירות שקיעה (SV) 10. עם זאת, השיטה הראשונה היא פשוטה לביצוע, והוא מתואר כאן. בSE, צנטריפוגה מתבצעת במהירות נמוכה מספיק כדי שהוא הגיע לשיווי משקל בין דיפוזיה ושקיעה. בשלב זה, פרופיל שיווי המשקל של אות אופטי (UV-VIS) כפונקציה של מרחק הרדיאלי, ניתן לנתח באמצעות מודלים תרמודינמיים שנקבע מראש לעמותות 11.
ve_content "> במאמר הנוכחי, מחקר שיווי משקל שקיעה מוצג העמותה העצמית של חלבון קרום ויראלי שיוצר יון ערוצים. בגלל הידרופוביות שלה, הניסוי מנוהל בנוכחות של חומר ניקוי, ובמקרה זה את הצפיפות ממס צריך להיות מתאים לזה של חומר הניקוי. עם זאת, הפרוטוקול מתואר היית זהה במקרה של חלבון מסיס במים, פרט לכך שלא תהיה צורך התאמת צפיפות ממס.החלבון משמש מקודד בוירוס syncytial הנשימה האנושי (hRSV), pneumovirus עטוף במשפחת paramyxoviridae שגורמת למחלות בדרכי נשימה תחתונה בתינוקות, קשישים ואוכלוסיות מדוכאי חיסון ברחבי העולם 12. עד 64 מיליון מקרים מדווחים של זיהום hRSV ו160,000 מקרי מוות מתרחשים בכל שנה.
הגנום hRSV מעתיק 11 חלבונים, ביניהם שלושה חלבוני קרום F, G, וקטן הידרופובי (SH). חלבון SH מעורבבפתוגנזה של זיהום RSV. RSV חסר את גן SH (RSVΔSH) היה בת-קיימא, שנגרם היווצרות syncytia וגדל, כמו גם את וירוס wild-type (WT) 13-16. עם זאת, וירוס RSVΔSH משוכפל פי 10 פחות יעיל מאשר WT בדרך הנשימה העליונה 15, 16. כמו כן, וירוס RSVΔSH היה מופחת בעכבר vivo ודגמי שימפנזה 13, 17.
החלבון הוא SH (תת-קבוצה RSV) 64 או 65 חומצות אמינו (תת-הקבוצה B RSV) סוג II חלבון קרום נפרד שמתרכז בעיקר בקרומים של תא Golgi 18 ארוך. חלבון SH יש אחד שחזה סליל תחום הטרנסממברני (TM) 19 אשר נשמרת 20,21 מאוד. תחומים extramembrane C- וN-terminal מכוונים lumenally / extracellularly וcytoplasmically, בהתאמה.
שני תחום TM הסינתטי (שאריות 18-43) וחלבון SH אורך מלא הוכחו בצורת homopentamers במגוון רחב של חומרי ניקוי. טופס homopentameric אחראי על פעילות ערוץ בbilayers שומנים מישוריים 22,23. הכיוון הנכון של מונומרים TM בbilayer השומנים נקבע תחילה באמצעות dichroism האתר הספציפי אינפרא אדום 23, אשר הראה-22 להיות בlumenal, קרובה להבין-סליל, אורינטציה. אותו כיוון תחום TM אושר על ידי מחקרי NMR ששחזרו את pentameric סליל-חבילה של החלבון באורך מלא בdodecylphosphocholine (DPC) מיצלות 22. במודל 'micelle' זה, תחום TM סליל a- יחיד היה מוקף N-סופני על ידי סליל, ו- C-סופני על ידי b-סיכת ראש ממושכת. שתי שאריות protonatable חלבון SH של, שלו 22 ו-51, נמצאים בתחום TM (האוריינטציה lumenally), ובקצה של סיכת ראש β C-מסוף extramembrane (רחוק מנקבובי הערוץ), בהתאמה. בenviro bicellarnment, לעומת זאת, α-helix TM משתרע עד-51, ושניהם השאריות שלו נגישות ללומן של הערוץ 24. מבנה ערוץ מאמצת ארכיטקטורה כמו משפך-22, שבו האזור הצר (Ser-29 לCys-45) 22 עטור שרשרות צד הידרופובי (Ile-32, Ile-36, Ile-40 וLeu-44), ו Ile-36 מגדיר את הנקודה הצרה ביותר בלומן הערוץ. שלו-22 ממוקם בפתיחה הגדולה ביותר של משפך זה, ואילו 51-הוא בקצה של הפתיחה הקטנה ביותר.
בעבודה הנוכחית, צנטריפוגה אנליטיות במצב שיווי משקל שקיעה נעשתה שימוש כדי לקבוע אם protonation משפיע על היציבות של pentamer חלבון SH. במקרה זה, חלבון SH היה solubilized בחומר ניקוי C14-betaine, אשר שימש בעבר כדי להראות שצורות חלבון SH oligomers pentameric 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מספק פרוטוקול ניסוי להכנת מדגם וניתוח של oligomerization של חלבון קרום קטן בחומר ניקוי באמצעות שיקוע שיווי משקל. הפרוטוקול המתואר באותה מידה תקף -ואז simpler- לחלבונים מסיסים, כמו לא נדרש צעד התאמת צפיפות. ואכן, המערכת היוותה ידי תערובת של חומרי ניקוי וחלבון. לערוך מחקרי …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. . Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions – Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- . . An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. . Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
