Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
Ultracentrifugazione analitica (AUC) può essere usato per studiare le interazioni reversibili tra macromolecole su una vasta gamma di forze di interazione e in condizioni fisiologiche. Questo rende AUC un metodo di scelta per valutare quantitativamente stechiometria e termodinamica di omo- ed etero-associazione che sono transitori e reversibili in processi biochimici. Nella modalità di sedimentazione equilibrio (SE), un equilibrio tra diffusione e sedimentazione fornisce un profilo in funzione della distanza radiale che dipende da un modello di associazione specifico. Qui, un protocollo dettagliato SE è descritto per determinare le dimensioni e monomero-monomero associazione energia di una piccola proteina di membrana oligomero utilizzando un'ultracentrifuga analitica. AUC-ES è privo di etichetta, basata solo su principi fisici, e può essere utilizzato su entrambe le proteine solubili e di membrana acqua. Un esempio è mostrato di quest'ultimo, la piccola idrofoba (SH) proteina del virus sinciziale respiratorio umano (HRSV), Un polipeptide di 65 aminoacidi con un singolo transmembrana (TM) dominio α-elica che forma canali ionici pentamerica. Dati strutturali a base di NMR mostra che la proteina SH ha due protonatable suoi residui nel suo dominio transmembrana che sono orientate ad affrontare il lume del canale. Esperimenti SE sono stati progettati per determinare come pH influenza costante di associazione e la dimensione oligomerica di proteine SH. Mentre la forma pentamerica stata conservata in tutti i casi, la costante associazione è stata ridotta a pH basso. Questi dati sono in accordo con una simile dipendenza pH osservato per l'attività del canale SH, in linea con un orientamento lumenal dei due suoi residui in proteine SH. Quest'ultima può verificare la repulsione elettrostatica e ridotto la stabilità oligomeri a basso pH. In sintesi, questo metodo è applicabile quando informazioni quantitative sottili proteina-proteina associazione cambiamenti nelle condizioni fisiologiche devono essere misurate.
Introduction
Ultracentrifugazione analitica 1-5 è uno dei metodi più importanti per studiare le interazioni di macromolecole in condizioni fisiologiche, essendo accessibile sia interazioni deboli e forti. Il metodo è privo di etichetta e utilizza assorbimento della luce o interferenze, e anche sistemi ottici fluorescenza può essere utilizzata per accedere intervalli di concentrazione di diversi ordini di grandezza 6.
Questo metodo è particolarmente utile in quanto la maggior parte dei processi biochimici dipendono interazioni reversibili. La stechiometria e la forza di tali interazioni devono essere caratterizzate quantitativamente comprendere processi biologici, e un certo numero di metodi esistono per questo scopo 7, 8. Tuttavia, interazioni transienti sono difficili da studiare 9.
La scelta di un metodo per caratterizzare le interazioni macromolecolari dipende dalla sua natura statica o dinamica. Nel primo caso, Sedim velocità entazione (SV) viene utilizzato, dove la velocità di trasporto radiale viene misurato e complessi sono frazionata sulla base delle differenze di massa galleggiante e forma.
Al contrario, le associazioni dinamiche che sono reversibili sulla scala temporale dell'esperimento non possono essere separati fisicamente. In questo caso, auto o etero-interazioni conducono a interazioni non-covalenti sono in un equilibrio che dipende dalla concentrazione totale di proteine. Queste interazioni dinamiche possono essere studiati sia equilibrio di sedimentazione (SE) e la velocità di sedimentazione (SV) 10. Tuttavia, il primo metodo è semplice da eseguire e viene descritto qui. In SE, centrifugazione viene eseguita ad una velocità sufficientemente bassa in modo da raggiungere un equilibrio tra diffusione e sedimentazione. A questo punto, il profilo di equilibrio di un segnale ottico (UV-VIS) in funzione della distanza radiale, può essere analizzato usando modelli termodinamici pre-impostato per associazioni 11.
ve_content "> Nel presente documento, uno studio sedimentazione equilibrio è presentato di auto-associazione di una proteina di membrana virale che forma canali ionici. A causa della sua idrofobicità, l'esperimento viene eseguito in presenza di detergente, e in questo caso la densità di solvente deve essere abbinato a quello del detergente. Tuttavia, il protocollo descritto sarebbe identica nel caso di una proteina solubile in acqua, salvo che nessuna corrispondenza densità solvente sarebbe necessaria.La proteina utilizzata è codificato nel virus sinciziale respiratorio umano (HRSV), un pneumovirus avvolto nel famiglia Paramyxoviridae che causa malattie respiratorie del tratto inferiore nei bambini, anziani e delle popolazioni di tutto il mondo 12 immunocompromessi. Fino a 64 milioni di casi segnalati di infezione HRSV e 160.000 decessi si verificano ogni anno.
Il genoma HRSV trascrive 11 proteine, comprese le tre proteine di membrana F, G, e piccola idrofoba (SH). Proteina SH è coinvoltanella patogenesi dell'infezione RSV. RSV manca il gene SH (RSVΔSH) è vitale, ha causato la formazione di sincizi e crebbe così come la wild-type (WT) virus 13-16. Tuttavia, virus RSVΔSH replicato 10 volte meno efficiente rispetto al WT nel tratto respiratorio superiore 15, 16. Inoltre, il virus è stato attenuato in RSVΔSH nel topo vivo e modelli scimpanzé 13, 17.
La proteina SH è un (RSV sottogruppo A) 64 o 65 (RSV sottogruppo B) aminoacidi lungo tipo II proteina integrale di membrana che si accumula prevalentemente alle membrane del vano 18 Golgi. Proteina SH ha un unico previsto a-elica transmembrana (TM) di dominio 19, che è altamente conservata 20,21. I domini extramembrane C- e N-terminale sono orientati lumenally / extracellulare e cytoplasmically rispettivamente.
Entrambi dominio TM sintetico (residui 18-43) E lunghezza piena SH proteine hanno dimostrato di formare homopentamers in una varietà di detergenti. La forma homopentameric è responsabile per l'attività del canale in doppi strati lipidici planari 22,23. Il corretto orientamento dei monomeri TM nel doppio strato lipidico è stato determinato in primo luogo con specifico sito dicroismo infrarossi 23, che ha mostrato la sua-22 per essere in un lumenal, vicino a inter-elica, orientamento. Lo stesso orientamento dominio TM è stato confermato da studi NMR che ricostruibili la pentamerica a-elica fascio della proteina intera lunghezza in dodecylphosphocholine (DPC) micelle 22. In questo modello di 'micelle', un singolo a- dominio TM elicoidale era affiancato N-terminale da un a-elica, e C-terminale da un esteso b-tornante. I due residui protonatable di proteine SH, His-22 e His-51, si trovano nel dominio TM (lumenally orientato), e sulla punta del extramembrane C-terminale β forcella (lontano dal poro canale), rispettivamente. In un enviro bicellarnment, tuttavia, il TM α-elica si estende fino a His-51, ed entrambi i suoi residui sono accessibili al lume del canale 24. La struttura del canale adotta un imbuto architettura 22, dove la strozzatura (Ser-Cys-29 a 45) 22 è allineato con catene laterali idrofobiche (Ile-32, Ile-36, Ile-Leu-40 e 44), e Ile-36 definisce il punto più stretto nel lume del canale. His-22 si trova presso la più grande apertura di questo imbuto, che His-51 è sulla punta della piccola apertura.
Nel presente documento, centrifugazione analitica in una modalità sedimentazione equilibrio è stato usato per determinare se la sua protonazione influisce sulla stabilità della proteina pentamero SH. In questo caso, la proteina SH è stato solubilizzato in detersivo C14-betaina, che è stato utilizzato in precedenza per dimostrare che le forme della proteina SH oligomeri pentamerica 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento fornisce un protocollo sperimentale per la preparazione e l'analisi di oligomerizzazione di una piccola proteina di membrana in detergente utilizzando equilibrio sedimentazione campione. Il protocollo descritto è ugualmente valido -e simpler- per proteine solubili, non è necessaria la fase corrispondente densità. Infatti, il sistema è costituito da una miscela di detergente e proteine. Per condurre studi sedimentazione, il detergente deve essere invisibile al campo gravitazionale modo che …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
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