작은 올리고머 형성 막 단백질의 침전 평형 : 펜타 머 안정성에 히스티딘 양성자의 효과
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
분석 용 초 원심 분리 (AUC)은 상호 작용의 세기의 광범위한 생리 학적 조건 하에서 고분자 사이의 가역적 인 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다. 이 AUC를 정량적으로 화학 양론과 호모 생화학 적 과정에 과도 되돌릴 수 있습니다 헤테로 협회의 열역학을 평가하기 위해 선택하는 방법을합니다. 침강 평형 양상 (SE)에서, 확산 침강 간의 균형은 특정 관계 모델에 따라 반경 방향 거리의 함수로서 프로파일을 제공한다. 여기서, SE 상세한 프로토콜 분석 초 원심 분리기를 사용하여 작은 막 단백질 올리고머의 크기와 연관 단량체 단량체 에너지를 결정하기 위해 설명된다. AUC-ES는 단지 물리적 원리에 기초하여, 라벨없는이며, 모두 수용성 단백질 및 막에 사용될 수있다. 예는 후자의 도시, 인간 호흡기 합 포체 바이러스의 작은 소수성 (SH) 단백질 (hRSV), 펜타 머 이온 채널을 형성하는 단일 나선 α 횡단 (TM) 도메인과 65 아미노산 폴리펩티드. 기반 구조 NMR 데이터는 SH 단백질이 채널의 루멘에 대향 배향의 막 횡단 도메인의 두 protonatable 그의 잔기를 갖는 것을 보여준다. SE 실험은 pH가 협회 상수와 SH 단백질의 올리고머 크기에 영향을 미치는 방법을 결정하기 위해 설계되었습니다. 펜타 머 형태는 모든 경우에 유지되었지만, 그 연관 상수는 낮은 pH에서 환원시켰다. 이러한 데이터는 SH 단백질의 두 그의 잔류의 내강 방향과 일치 SH 채널 활동에 대한 관찰과 유사한의 pH 의존성과 일치한다. 후자는 낮은 pH에서 정전 기적 반발력 감소 올리고머 안정성이 발생할 수 있습니다. 생리 학적 조건의 미묘한 단백질 – 단백질 연관 변경 정량적 정보를 측정 할 수있을 때마다 요약하면,이 방법은 적용 가능하다.
Introduction
분석 용 초 원심 1-5, 생리 학적 조건하에 거대 분자의 상호 작용을 연구 강약의 상호 작용 모두에 액세스 가능한 가장 중요한 방법 중 하나이다. 방법은 라벨없는이고 광 흡수 또는 간섭을 사용하며, 심지어 형광 광학 시스템 (6)의 크기는 몇 배 이상 농도 범위를 액세스하기 위해 사용될 수있다.
대부분의 생화학 적 과정이 가역적 인 상호 작용에 의존하기 때문에이 방법은 특히 유용합니다. 이러한 상호 작용의 강도 화학량 정량적 생물학적 과정을 이해하는 것을 특징으로 할 수 있고, 다수의 방법이 목적 7,8 존재한다. 그러나, 과도 상호 작용을 연구 9 어렵다.
거대 분자의 상호 작용을 특성화하는 방법의 선택은 정적 또는 동적 인 특성에 의존한다. 첫 번째 경우, sedim 정해져있는 속도 (SV)는 방사상 운송 속도가 측정되고, 복합체는 부력 질량 및 형상의 차이에 기초하여 분획 화되는 경우, 사용된다.
반면에, 실험의 시간 스케일에 가역적 동적 연결은 물리적으로 분리 될 수 없다. 이 경우, 자기 또는 비 – 공유 상호 작용으로 이어지는 헤테로 상호 작용은 총 단백질 농도에 의존 평형에있다. 이러한 동적 상호 작용 침강 평형 (SE) 및 침강 속도 (SV) (10) 모두 공부하실 수 있습니다. 그러나, 첫 번째 방법을 수행하는 단순하고 여기에 설명된다. 평형 확산 침강 사이 도달되도록 SE에서 원심 충분히 낮은 속도로 수행된다. 이 시점에서, 반경 방향 거리의 함수로서 광 신호 (UV-VIS)의 평형 프로필은, 연관 (11)에 대해 미리 설정된 열역학적 모델을 사용하여 분석 될 수있다.
ve_content "> 본 논문에서는 침강 평형 연구 때문에 그 소수성. 이온 채널을 형성 바이러스 막 단백질의 자기 연관으로 제시되고, 실험은 세제의 존재 하에서 실행하고,이 때의 밀도이다 용매 세제와 정합되어야한다. 그러나,이 프로토콜에는 용매 농도 정합이 요구되지 것 이외에는, 수용성 단백질의 경우에서와 동일한 기재.사용되는 단백질은 인간의 호흡기 세포 융합 바이러스 (hRSV),하기도 유아 질환, 노인과 면역 인구 전세계 12 원인 paramyxoviridae 제품군의 포락선 pneumovirus 인코딩됩니다. hRSV 감염의 최대 64,000,000보고 된 사례와 160,000 사망 매년 발생합니다.
게놈은 hRSV 세 막 단백질 F, G, 및 작은 소수성 (SH) 단백질을 포함한 11, 사본을 만듭니다. SH 단백질이 관여RSV 감염의 발병. SH 유전자 (RSVΔSH)를 결여 RSV는 실용적이었다 syncytia의 형성을 야기하고, 야생형 (WT) 바이러스뿐만 아니라 13-16 자랐다. 그러나 RSVΔSH 바이러스는 상부 호흡기 (15, 16)에보다 덜 효율적 WT 1/10 복제. 또한, RSVΔSH 바이러스는 생체 내 마우스와 침팬지 모델 13, 17에서 감쇠했다.
SH 단백질 64 (RSV 하위 그룹 A) 또는 65 (RSV의 서브 그룹 B) 아미노산으로 유형 골지 실 (18)의 막에 주로 축적 II 세포막 단백질이다. SH 단백질은 하나의 높은 (20, 21)를 보존하는 나선 막 횡단 (TM) 도메인 (19) 예측이있다. C- 및 N- 말단 extramembrane 도메인은 lumenally / 세포 외 및 세포질, 각각 지향하고 있습니다.
모두 합성 TM 도메인 (잔류 물 (18)-43)과 전체 길이 SH 단백질은 세제의 다양한 homopentamers를 형성하는 것으로 나타났다. homopentameric 형태는 평면 22,23 지질 이중층에서 채널 활동에 대한 책임이있다. 지질 이중층의 TM 단량체의 올바른 방향은 먼저 그의-22는, 내강에 가까운 방향, 간 나선형의 제품에 보였다 사이트 특정 적외선 이색 (23)를 사용하여 측정 하였다. 동일한 TM 도메인 배향 (DPC)에 dodecylphosphocholine 펜타 머에게 전장 단백질의 나선 다발 (22)을 재구성 미셀 NMR 연구에 의해 확인 하였다. 이 '미셀'모델에서, 단일의 헬리컬 A- TM 도메인 확장 헤어핀 B-C에 의해 말단 나선 의해 N 말단 어귀 하였다. SH 단백질의 두 protonatable 잔류, 그의-22과 그분의-51, TM 도메인 (lumenally 방향)에 위치하며, extramembrane의 C- 말단 β 머리핀의 끝에서 각각, (지금까지 채널 기공에서). bicellar ENVIRO에서nment 그러나, TM의 α 나선 그의-51까지 연장하고, 그 잔류 물은 두 채널 (24)의 내강에 접근 할 수있다. 22 소수성 사이드 체인 (일드-32, 일드-36, 일드-40와 레우-44), 그리고 줄 지어 채널 구조는 깔때기 모양의 구조 (22), 좁은 지역 채택 (의 Cys-45 빼앗아-29)은 일드-36는 채널 루멘의 좁은 지점을 정의합니다. 그의-51가 가장 작은 개구 선단에있는 반면, 그의-22은,이 깔때기의 가장 큰 개방에 있습니다.
본 논문에서는 침강 평형 모드에서 원심 분리 분석이 그의 양성자 SH 량체 단백질의 안정성에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 사용되어왔다. 이 경우, SH 단백질은 그 단백질 SH 형 펜타 머 올리고머 22 보여 이전에 사용 된-C14 베타 인 세제, 가용화 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 샘플 준비 및 평형 침을 사용하여 세제의 작은 막 단백질의 올리고머의 분석을위한 실험 프로토콜을 제공합니다. 밀도 정합 단계가 필요하지 않은 것으로 설명 프로토콜은 동등하게 유효한 -and simpler- 가용성 단백질이다. 실제로, 시스템은 세제와 단백질의 혼합물로 구성된다. 이 부유 입자에 기여하지 않도록 침강 연구를 수행하기 위해, 세제 중력장에 보이지이어야한다. 따라서, 세제…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
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