Седиментационного равновесия небольшой олигомер-формирования мембранного белка: Влияние гистидин ПРОТОНИРОВАНИЕ на пентамерного стабильности
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
Аналитический ультрацентрифугирования (AUC) может быть использован для изучения обратимые взаимодействия между макромолекул в широком диапазоне сильных взаимодействий и в физиологических условиях. Это делает AUC метод выбора для количественной оценки стехиометрии и термодинамика гомо- и гетеро-ассоциации, являются временными и обратимым в биохимических процессах. В модальности седиментационного равновесия (SE), баланс между диффузии и седиментации обеспечивает профиль как функцию радиального расстояния, которое зависит от конкретной модели объединения. При этом Подробный протокол SE описано для определения размера и мономера-мономера ассоциации энергию малой мембранного белка олигомера с использованием аналитического ультрацентрифугирования. AUC-ES является метка свободной, только на основе физических принципов, и могут быть использованы на обеих водорастворимых и мембранных белков. Пример показан последнего, небольшой гидрофобной (SH) белков в респираторно-синцитиальный вирус человека (РСВЧ), Полипептид 65-аминокислоты с одного домена α-спиральный трансмембранный (ТМ), который образует пентамерного ионные каналы. ЯМР основе структурного данные показывают, что белок SH имеет два протонируемых Его остатки в его трансмембранного домена, которые ориентированы, с которыми сталкиваются в просвет канала. SE эксперименты были разработаны, чтобы определить, как рН влияет на константу ассоциации и олигомерные размер SH белка. В то время как пентамерного форма была сохранена во всех случаях, его постоянным ассоциации была снижена при низком рН. Эти данные согласуются с аналогичным рН зависимости, наблюдаемой для деятельности SH канала, в соответствии с люменальной ориентации двух Своих остатков в SH белка. Последнее может возникнуть электростатическое отталкивание и снижает стабильность олигомеров при низком рН. Таким образом, этот метод применим, когда количественной информации о тонкие изменения белок-белковых ассоциаций в физиологических условиях должны быть измерены.
Introduction
Аналитический ультрацентрифугирования 1-5 является одним из наиболее важных способов для изучения взаимодействия макромолекул в физиологических условиях, будучи доступной для обеих слабых и сильных взаимодействий. Метод без наклеек и использует поглощение света или вмешательства, и даже флуоресцентные оптические системы могут быть использованы для доступа диапазоны концентрации в течение нескольких порядков 6.
Этот метод особенно полезен, так как большинство биохимических процессов зависят от обратимых взаимодействий. Стехиометрии и прочность этих взаимодействий должны быть количественно охарактеризовать понимать биологические процессы, а также ряд методов существуют для этой цели 7, 8. Тем не менее, переходные взаимодействия трудно изучать 9.
Выбор метода для характеристики высокомолекулярные взаимодействия зависит от его статического или динамического характера. В первом случае, sedim ставление скорость (SV) используется, когда скорость радиального транспорта измеряется и комплексы фракционируют на основании различий в плавучей массы и формы.
В отличие от этого, динамические ассоциации, которые обратимо на временной шкале эксперимента не может быть физически отделена. В этом случае, само или гетеро-взаимодействия, ведущие к нековалентных взаимодействий в равновесии, которое зависит от общей концентрации белка. Эти динамические взаимодействия могут быть изучены как седиментационного равновесия (SE) и скорости оседания (SV) 10. Тем не менее, первый способ является более простым для выполнения и описано здесь. В SE, центрифугирование провод т при достаточно низкой скорости, так что не будет достигнуто равновесие между диффузии и седиментации. В этот момент, равновесный профиль оптического сигнала (UV-VIS) как функцию радиального расстояния, могут быть проанализированы с использованием заранее установить термодинамических моделей для ассоциаций 11.
ve_content "> В данной работе, седиментационного равновесия исследование представлено в самоассоциации вирусной мембранного белка, который образует ионные каналы. Из-за своей гидрофобности, эксперимент проводят в присутствии детергента, и в этом случае плотность Растворитель должен быть согласован с, что моющего средства. Однако, протокол, описанный будет идентична в случае растворимого белка воды, за исключением того, что нет соответствующего растворител плотность не потребуется.Белок, используемый кодируется в человеческом респираторно-синцитиальный вирус (РСВЧ), оболочечным пневмовирусов в семье Paramyxoviridae, что вызывает болезнь нижних дыхательных путей у младенцев, пожилых и престарелых, с ослабленным иммунитетом населения во всем мире 12. До 64 миллиона зарегистрированных случаев РСВЧ инфекции и 160000 смертей происходят каждый год.
РСВЧ геном транскрибирует 11 белков, в том числе три мембранных белков F, G, и малые гидрофобные (SH). SH белок участвуетв патогенезе инфекции RSV. РСВ отсутствует ген Sh (RSVΔSH) был жизнеспособным, вызвало образование синцитиев и росли, а также дикого типа (WT) вируса 13-16. Тем не менее, вирус RSVΔSH воспроизведены в 10 раз менее эффективно, чем WT в верхних дыхательных путей 15, 16. Кроме того, вирус RSVΔSH был ослаблен в естественных условиях мыши и моделей шимпанзе 13, 17.
SH белок 64 (RSV подгруппы А) или 65 (РСВ подгруппа B) аминокислот длиной Тип II интегральный мембранный белок, который накапливается в основном на мембранах отсека Гольджи 18. SH белок имеет одного предсказывали-спиральных трансмембранных (ТМ) домен 19, который высоко консервативен 20,21. С- и N-концевые extramembrane домены ориентированы lumenally / внеклеточно и в цитоплазме, соответственно.
Как синтетические, так ТМ домен (остатки 18-43) И в полный рост SH белок, как было показано, чтобы сформировать homopentamers в различных моющих средств. Homopentameric форма отвечает за активность канала в планарных липидных бислоев 22,23. Правильная ориентация ТМ мономеров в липидный бислой впервые определена с использованием сайт-специфическое инфракрасное дихроизм 23, который показал, His-22, чтобы быть в люменальной, близко к интер-цилиндрических, ориентации. Та же ориентация ТМ домен с помощью ЯМР исследований, реконструированных пентамерного А-спиральной расслоение полноразмерного белка в dodecylphosphocholine (DPC) мицеллы 22. В этой модели "мицеллы", одного а-домен спиральной ТМ бокам N-терминальной по а-спирали и С-конце с помощью расширенного б-шпильке. Два протонируемых остатки SH белка, His-22 и его-51, которые расположены в области ТМ (lumenally ориентированной), и в наконечнике extramembrane С-концевой β шпильку (недалеко от поры канала), соответственно. В bicellar ENVIROnment, однако, ТМ α-спираль проходит до His-51, и оба его остатки доступны в просвет канала 24. Структура канала принимает воронки, как архитектура 22, где узкий участок (Ser-Cys 29 с-45) 22 выровнена с гидрофобными боковыми цепями (Ile-32, Ile-36, Ile-40 и Leu-44), и Иле-36 определяет самом узком месте в канале просвета. Его-22 располагается на самом большом открытием этого воронку, в то время как His-51 находится в наконечнике маленького отверстия.
В настоящей работе, аналитическое центрифугирование с в режиме седиментационного равновесия была использована для определения, если его протонирования влияет на стабильность SH белка пентамер. В этом случае, SH белок солюбилизируют в С14-бетаина моющего средства, который был использован ранее, чтобы показать, что белок SH формы пентамерного олигомеры 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья представляет собой экспериментальный протокол для подготовки и анализа олигомеризации малого мембранного белка в моющем средстве с помощью равновесной седиментации образца. Протокол, описанный в равной степени относится -А simpler- для растворимых белков, а соответствующий п…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. . Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions – Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- . . An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. . Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
