Sedimente Equilibrium av en liten oligomerbildande membranprotein: Effekt av histidin Protone på pentamer stabilitet

Summary

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Abstract

Analytisk ultracentrifugering (AUC) kan användas för att studera reversibla interaktioner mellan makromolekyler över ett brett område av interaktions styrkor och under fysiologiska betingelser. Detta gör AUC en metod för val att kvantitativt bedöma stökiometri och termodynamik homo- och hetero förening som är övergående och reversibla i biokemiska processer. I modaliteten av sedimente jämvikt (SE), en balans mellan diffusion och sedimentation ger en profil som en funktion av radiellt avstånd som är beroende av en specifik förening modell. Häri är ett detalj SE protokoll som beskrivs för att bestämma storleken och monomer-monomer association energi av en liten membranprotein oligomer använder en analytisk ultracentrifug. AUC-ES är etikettfritt, endast bygger på fysikaliska principer, och kan användas på både vattenlösliga och membranproteiner. Ett exempel visas av den senare, den lilla hydrofoba (SH) protein i humant respiratoriskt syncytialvirus (HRSV), En 65-aminosyrapolypeptid med en enda α-helixtrans (TM) domän som bildar penta jonkanaler. NMR-baserade strukturell data visar att SH proteinet har två protonatable His-rester i dess transmembrandomän som är orienterade som vetter mot lumen av kanalen. SE experiment har utformats för att bestämma hur pH-värdet påverkar associationskonstant och den oligomera storlek SH-protein. Medan den pentamera formen bevarades i samtliga fall, var dess associationskonstant minskas vid lågt pH. Dessa data överensstämmer med en liknande pH beroende observerats för SH kanalaktivitet, förenligt med en lumen orientering av de två His rester i SH-protein. Det senare kan uppleva elektrostatisk repulsion och minskad oligomer stabilitet vid lågt pH. Sammanfattningsvis är detta förfarande tillämpligt när kvantitativ information om subtila protein-proteinassociations förändringar i fysiologiska betingelser måste mätas.

Introduction

Analytisk ultracentrifuge ^1-5 är en av de viktigaste metoderna för att studera interaktioner mellan makromolekyler under fysiologiska förhållanden, vara tillgänglig för både svaga och starka växelverkan. Metoden är märkningsfri och använder Ijusabsorption eller störningar, och även fluorescens optiska system kan användas för att få tillgång till koncentrationsintervall över flera tiopotenser ^6.

Denna metod är särskilt användbar eftersom de flesta biokemiska processer är beroende av reversibla interaktioner. Stökiometri och styrka dessa interaktioner måste kvantitativt att förstå biologiska processer, och ett antal metoder finns för detta ändamål ^{7, 8.} Men transienta interaktioner är svårt att studera ^9.

Valet av en metod för att karaktärisera makromolekylära interaktioner beror på dess statiska eller dynamiska karaktär. I det första fallet, sedim Utformning hastighet (SV) används, där andelen radiella transporter mäts och komplex fraktion utifrån skillnader i flytande massa och form.

Däremot dynamiska föreningar som är reversibla på tidsskalan för försöket inte kan separeras fysiskt. I detta fall, själv- eller hetero interaktioner som leder till icke-kovalenta interaktioner är i en jämvikt som beror på den totala proteinkoncentrationen. Dessa dynamiska interaktioner kan studeras genom både sedimente jämvikt (SE) och sedimentehastighet (SV) ^10. Emellertid är den första metoden enklare att utföra och beskrivs här. I SE är centrifuge utförs vid en tillräckligt låg hastighet så att en jämvikt nås mellan diffusion och sedimentation. Vid denna punkt, jämviktsprofilen hos en optisk signal (UV-VIS) som en funktion av radiellt avstånd, kan analyseras med användning av förinställda termodynamiska modeller för föreningar ^11.

ve_content "> I föreliggande papper, är en sedimenteringsjämvikt studie presenterades av självassociering av ett viralt membranprotein som bildar jonkanaler. På grund av sin hydrofobicitet, är experimentet körs i närvaro av detergent, och i detta fall densiteten för lösningsmedel måste matchas till den hos tvättmedel. Emellertid, det protokoll som beskrivits skulle identiska i fallet med ett vattenlösligt protein, med undantag av att inget lösningsmedel densitetsmatchning skulle krävas.

Proteinet används är kodad i RSV (HRSV), ett hölje pneumovirus i Paramyxoviridae familjen som orsakar nedre luftvägsinfektioner hos spädbarn, äldre och nedsatt immunförsvar befolkningar i världen ^12. Upp till 64 miljoner rapporterade fall av HRSV-infektion och 160.000 dödsfall inträffar varje år.

HRSV genomet transkriberar 11 proteiner, inklusive de tre membranproteiner F, G, och små hydrofoba (SH). SH-protein är inblandati patogenesen av RSV-infektion. RSV saknar SH-genen (RSVΔSH) var lönsamt, orsakade bildning av syncytia och växte liksom vildtypen (WT) virus ^13-16. Emellertid RSVΔSH viruset replik 10-faldigt mindre effektivt än WT i de övre luftvägarna ^{15, 16.} Dessutom var RSVΔSH virus dämpas i in vivo mus och schimpans modellerna ^{13, 17.}

SH-proteinet är en 64 (RSV subgrupp A) eller 65 (RSV subgrupp B) aminosyror lång typ II integralt membranprotein som ackumuleras mestadels på membranen i Golgi-facket ^18. SH-protein har en enda förutspådde en-helixtrans (TM) domän ¹⁹ som är mycket bevarad ^20,21. C- och N-terminala extramembrane domänerna är orienterade lumenally / extracellulärt och cytoplasmatiskt, respektive.

Både syntetiska TM domän (rester 18-43) Och full längd SH protein har visat sig bilda homopentamers i en mängd olika rengöringsmedel. Den homopentameric formen är ansvarig för kanalaktivitet i plana lipiddubbelskikt ^22,23. Den korrekta orienteringen av TM monomerer i lipiddubbelskiktet bestämdes först med användning av platsspecifik infraröd dikroism ^23, som visade His-22 att vara i en lumen, nära inter spiralformig, orientering. Samma TM domän orientering bekräftades genom NMR-studier som rekonstruerade den pentamera a-helix bunt av fullängdsprotein i dodecylphosphocholine (DPC) miceller ^22. I denna "micell" modell, var ett enda a- spiralformad TM-domänen flankerad N-terminalt av en a-helix, och C-terminalt av en utökad B-hårnål. De två protonatable rester av SH-protein, His-22 och His-51, är belägna i TM-domänen (lumenally orienterad), och vid spetsen av den extramembrane C-terminala β hårnål (långt från kanal por), respektive. I en bicellar Environment emellertid förlänger TM α-helix upp till His-51, och båda His-rester är tillgängliga för lumen i kanalen ^24. Kanalen strukturen antar en trattliknande arkitektur ^22, där den smalare regionen (Ser-29 till Cys-45) ²² är fodrad med hydrofoba sidokedjor (Ile-32, Ile-36, Ile-40 och Leu-44), och Ile-36 definierar den smalaste punkten i kanal lumen. His-22 ligger vid den största öppningen av denna tratt, medan His-51 är vid spetsen på den minsta öppningen.

I föreliggande dokument, har analytisk centrifugering i en sedimentejämviktsläge använts för att avgöra om hans protonisering påverkar stabiliteten i SH protein pentameren. I detta fall var SH protein löses i C14-betaindetergent, som har använts tidigare för att visa att SH proteinformer penta oligomerer ^22.

Protocol

Detta protokoll är baserad på följande resurser, som skall anges för mer information och särskilda överväganden 3, 25-28. 1. Densitet matchning av detergentmiceller med 2 H2O Obs: Densiteten hos buffertlösningen måste matchas till densiteten hos de detergentmiceller. Vanliga densitetsjusterande medel inkluderar 2 H2O, H 2 18 O, 2 H 2 18 O, glycerol…

Representative Results

Den radiella fördelningen profil C14SB detergentmiceller i 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7.3 bildar ett mycket grunt exponentiell som skulle monteras på en linjär modell (figur 7A). Lutningen för denna distribution är omvänt korrelerad till D2O koncentration (Figur 7B). Den punkt där lutningen är noll, dvs, den matchande D2O koncentration, befanns vara 32,3%. Se figur 7 nedan. …

Discussion

Denna uppsats ger en experimentell protokoll för beredning och analys av oligomerisering av en liten membranprotein i tvättmedel använder jämviktssedimenteprov. Protokollet som beskrivs är lika giltiga -och simpler- för lösliga proteiner, som densiteten matchningssteget inte krävs. Faktum är att systemet utgörs av en blandning av detergent och protein. För att genomföra sedimente studier måste tvättmedels vara osynlig för gravitationsfältet så att det inte bidrar till partikel flotation. Sålunda har de…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate	Sigma	T0807
Deuterium oxide 99.8%	Cambridge Isotope	DLM-4-99.8
An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place	Beckman Coulter	361964
Cell housing	Beckman Coulter	334784
12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled	Beckman Coulter	331376
Window holder	Beckman Coulter	305037
Window gasket	Beckman Coulter	327021
Window liner	Beckman Coulter	362329
Sapphire window	Beckman Coulter	307177
Quartz window	Beckman Coulter	301730
Screw-ring washer	Beckman Coulter	362328
Screw ring	Beckman Coulter	301922
Spinkote	Beckman Coulter	306812
Torque stand assembly	Beckman Coulter	361318
Counterbalance	Beckman Coulter	360219
Cell alignment tool	Beckman Coulter	362340
SEDNTERP			http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis			http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm
SEDPHAT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm