نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
ويرتبط عدوى الإنفلونزا مع حوالي 36،000 حالة وفاة وأكثر من 200،000 المستشفيات كل عام في الولايات المتحدة. ظهور المستمر من سلالات فيروس الإنفلونزا الجديدة بسبب طفرة وإعادة تشكيلة-يعقد السيطرة على الفيروس ويتطلب التطوير الدائم لأدوية جديدة واللقاحات. الدراسة المختبري للأنفلونزا تتطلب طريقة موثوق بها وفعالة من حيث التكلفة لنشر الفيروس. هنا، يتم توفير بروتوكول شامل للأنفلونزا A انتشار الفيروس في بيض الدجاج الخصبة والتي ينتج باستمرار عيار ارتفاع الأسهم الفيروسية. وباختصار، يتم تحضين خالية من مسببات الأمراض المصل (SPF) بيض الدجاج المخصب عند 37 درجة مئوية والرطوبة 55-60٪ لمدة 10 – 11 يوما. خلال هذه الفترة، تطور الجنين يمكن رصدها بسهولة باستخدام كاندلر البيض. ويتم التلقيح خارج الفيروس عن طريق الحقن من الأسهم الفيروس في جوف السقاء باستخدام إبرة. 2 بعد أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، والبيضمبردة لمدة 4 على الأقل ساعة على 4 درجات مئوية. قشر البيض فوق كيس الهواء وغشاء مشيمائي يتم بعد ذلك فتحت بعناية، ويتم حصاد السائل السقاء التي تحتوي على الفيروس. تم مسح السوائل من الحطام بواسطة الطرد المركزي، aliquoted ونقل إلى -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. وقد جعلت كمية كبيرة (5-10 مل من السوائل في البيض التي تحتوي على فيروس) وفيروس عيار عالية والتي عادة ما يتحقق مع هذا البروتوكول استخدام البيض لتحضير فيروس أسلوبنا مواتية، ولا سيما بالنسبة للفي الدراسات المختبرية التي تتطلب كميات كبيرة من الفيروسات التي هناك حاجة جرعات عالية من الأسهم الفيروس نفسه.
Introduction
الأنفلونزا A لا يزال يشكل خطرا كبيرا على صحة الإنسان. وهو مرض الجهاز التنفسي يمكن أن يكون مدمرا مع العبء العالمي الكبير يسبب ما يصل إلى 500،000 حالة وفاة سنويا حول العالم 1. فيروسات الأنفلونزا هي في الأسرة فيروسات مخاطية قويمة وتحمل 8-الشعور السلبي RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل في الجينوم من 1،2. التحولية عالية (أي الأنتيجين "الانجراف") من الجينوم الفيروسي يمنع مناعة طويلة الأمد. وعلاوة على ذلك، الانفلونزا بشكل متزايد مقاومة للعقاقير المضادة للفيروسات 3.
سلط الضوء على وباء انفلونزا H1N1 2009 جميع القضايا الصعبة المرتبطة بمرض أنفلونزا (سلالة وبائية، ومقاومة مضادة للفيروسات، وإنتاج لقاح تأخر). يتم تحديد تركيبة اللقاح سنويا من قبل منظمة الصحة العالمية لسلالات الأنفلونزا الأكثر احتمالا المسببة للأمراض (واحد في كل من H1N1، H3N2 وانفلونزا B) 4. لأنه يعتمد هذا الأسلوب على سلالة انفلونزا تنبأالصورة، وأحيانا تحديدها بشكل غير صحيح السلالات المسببة للأمراض وقطرات نجاعة اللقاح بشكل كبير. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ظهور سلالات الأنفلونزا الجديدة الالتفاف على هذه البرامج الوقائية المسببة للأمراض الوبائية 2.
وقد تم إنشاء لقاح الأنفلونزا العالمي راوغ 5. لذلك، يجب أن تستمر الأبحاث في فهم التسبب في إصابة الرئة. لالبحوث المختبرية المرفق، وقد وضعت عدة طرق لعزل الفيروسية ونشر 6. يمكن أن فيروسات الأنفلونزا البشرية أن تتسع دائرة في مجموعة متنوعة من ركائز خلايا الثدييات. ومع ذلك، فإن أفضل طريقة لتحقيق توليد الفيروسات عيار عالية بكميات كبيرة في البيض المحتوي. يصف بروتوكول التالية تقنية لنشر فيروس الأنفلونزا A والتخزين من مخزونات فيروس القائمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسبب الإنفلونزا في العبء العالمي للمرض واسع، ويستمر العمل في فهم التسبب في إصابة الرئة 7. لبحث سهلت في هذا المرض الفتاك، وضعت أساليب مختلفة لنشر فيروس انفلونزا 6. هنا، نحن تصف تقنية لإنتاج فيروس الإنفلونزا في بيض الدجاج. وميزة هذه الطريقة هي أنها تكرار للغ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
