Influenza virusformering i befrugtede hønseæg
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
Influenza infektion er forbundet med omkring 36.000 døde og mere end 200.000 indlæggelser hvert år i USA. Den kontinuerlige fremkomsten af nye influenzavirusstammer på grund af mutation og reassortment komplicerer styring af virus og nødvendiggør permanent udvikling af nye lægemidler og vacciner. Den laboratorieundersøgelse af influenza kræver en pålidelig og omkostningseffektiv metode til formering af virus. Her er en omfattende protokollen i henhold til influenza A-virus formering i frugtbare hønseæg, som konsekvent giver høj titer virale lagre. I korte træk er serum patogenfrie (SPF) befrugtede hønseæg inkuberet ved 37 ° C og 55-60% luftfugtighed 10 – 11 dage. I denne periode, kan udvikling embryo let overvåges ved hjælp af et æg Candler. Virus podning udføres ved injektion af virus lager i allantoiskaviteten hjælp af en nål. Efter 2 dages inkubation ved 37 ° C, æggene erkølet mindst 4 timer ved 4 ° C. Æggeskallen over luftsækken og chorioallantoiske membran bliver derefter omhyggeligt åbnet, og allantoisvæske indeholdende virus høstes. Væsken fjernes fra rester ved centrifugering, alikvoteret og overført til -80 ° C til langtidsopbevaring. Den store mængde (5-10 ml virusholdige væske pr æg) og høj virustiter som sædvanligvis opnået med denne protokol har gjort brugen af æg til viruspræparat vores gunstig metode, især til in vitro-undersøgelser, der kræver store mængder af virus, hvor høje doser af det samme virus lager er nødvendige.
Introduction
Influenza A er fortsat en stor trussel mod menneskers sundhed. Det er en potentielt ødelæggende luftvejssygdom med en stor global byrde forårsager op til 500.000 dødsfald på verdensplan om året 1. Influenzavirus er i familien Orthomyxoviridae og bære 8 negativ-sense enkeltstrenget RNA i deres genom 1,2. Den høje foranderlighed (dvs. antigen "drift") af det virale genom forhindrer langsigtede immunitet. Desuden influenza er mere resistente over for antivirale lægemidler 3.
2009 H1N1 influenza pandemi Den fremhævede alle de udfordrende spørgsmål i forbindelse med influenza sygdom (pandemiske stamme, anti-viral resistens, forsinket vaccine produktion). Vaccineformuleringen bestemmes hvert år af World Health Organization for de mest sandsynlige patogene influenzastammer (én hver for H1N1, H3N2 og influenza B) 4. Fordi denne metode er baseret på forudsagt stamme influenzas, er patogene stammer lejlighedsvis ukorrekt identificeret og vaccinens effekt falder drastisk. Endvidere kan forekomsten af nye influenzastammer omgå disse forebyggende programmer forårsager pandemi 2.
Oprettelsen af en universel influenzavaccine har været undvigende 5. Derfor skal forskningen fortsætte ind forstå patogenesen af lungeskade. Til anlægget laboratorium forskning, er der udviklet flere metoder til viral isolation og formering 6. Humant influenzavirus kan amplificeres i en række pattedyrscellelinier substrater. Men genererer høj titer virus i store mængder bedst opnås i befrugtede æg. Den følgende protokol beskriver en teknik til influenza A-virus formering og opbevaring fra eksisterende virusstammer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Influenza forårsager en stor globale sygdomsbyrde, og arbejdet fortsætter i forståelsen af patogenesen af lungeskade 7. Til lettere forskning i denne dødelige sygdom er der blevet udviklet forskellige metoder til at udbrede influenzavirus 6. Her beskriver vi en teknik til at producere influenzavirus i hønseæg. Fordelen ved denne metode er, at det er meget reproducerbar og resulterer i store mængder af høj titer influenza virusstammer, som ofte er nødvendig til in vitro studier. </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
