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Biologie

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em> 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Published: February 16, 2015
doi:
10.3791/52428
, , ,
1Department of Biology,Ball State University, 2Division of Nephrology,Cincinnati Children’s Hospital

Summary

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Abstract

규제 단백질 분해는 거의 모든 세포의 기능에 매우 중요합니다. 분자 메커니즘 및 진핵 세포 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항에 대해 알려진 대부분은 처음 사카로 미세스 세 레비 시아 년에 설립되었습니다. 단백질 분해의 고전 분석은 생화학 펄스 추적 및 사이클로 헥 – 추적 방법에 의존했다. 이들 기술은 단백질 분해에 대한 민감성을 관찰하는 수단을 제공하지만, 이들은 힘들고, 시간 소모, 및 낮은 처리량이다. 이러한 접근 방법은 단백질 분해를 방지 또는 돌연변이 신속한 대규모 스크리닝 의무가 없다. 여기에서, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건 용이 한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석법을 설명한다. 이 분석에서, 특정 조건 하에서 선택적 성장에 필요한 리포터 효소 불안정한 단백질에 융합된다. 내생 세포를 리포터 효소가 결여되지만 융합 단백질이 실리 하에서 성장할 수있는 발현융합 단백질 안정화 만 뽑은 상태 (즉, 단백질 분해가 노출되어있는 경우). 여기에 설명 된 성장 분석에서, 야생형 및 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 돌연변이 효모 세포의 연속 희석이 선택적 및 비 선택적 매체에 발견된다. 선택적 성장 조건 하에서 주어진 돌연변이 열화 손상과 일치한다. 증가 된 단백질 풍부 생화학 적으로 확인해야합니다. 전기 영동 및 웨스턴 블 랏팅을위한 적합한 형태로 효모 단백질의 신속한 추출 방법도 설명된다. 생화학 적 분석을위한 단백질 추출을위한 간단한 프로토콜과 결합 단백질 안정성 성장 기반 판독, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건의 신속한 식별을 용이하게한다. 이러한 기술들은 단명 다양한 단백질의 열화를 모니터링하도록 구성 될 수있다. 제시된 예에서, 히스티딘 생합성에 필요한 효소는 HIS3, 융합시켰다이 비정상적으로 소포체의 translocon을 종사 한 후 Deg1에 -Sec62. Deg1 -Sec62은 분해의 대상이된다. Deg1 -Sec62-HIS3 은닉 세포 단백질을 안정화시킨 때 선택적 조건 하에서 성장할 수 있었다.

Introduction

선택적 단백질 분해 진핵 생명에 필수적이며, 변화된 단백질 분해는 여러 종류의 암, 퇴행성 신경 질환, 심혈관 질환, 낭포 성 섬유증을 포함하는 의료 1-5 조건의 수에 기여한다. 선택적인 단백질 분해를 촉매하는 유비퀴틴 – 프로 테아 좀 시스템 (UPS)는, 이러한 조건에 대한 6-10 새로운 치료 표적이다. 유비퀴틴 리가 제는 공유 결합 단백질 11 (76) – 아미노산 유비퀴틴의 폴리머를 연결합니다. polyubiquitin 체인으로 표시 한 단백질은 인정 ~ 2.5 megadalton 26S에 의해 12 프로 테아 proteolyzed 있습니다. 모델 진핵 생물 사카로 미세스 세 레비 시아 (신진 효모)에 시작된 연구는 진핵 세포에서 단백질 분해 메커니즘의 해명에 기초가되고있다. UPS의 첫 번째 시연 생리 기판은 MATα2 13 효모 전사 억제 자했다, UPS의 (14), 및 고도로 보존 된 많은 구성 요소가 처음 확인 된 또는 (예 15-26) 효모 특징으로하는 방법. 이 다목적 유전자 다루기 쉬운 모델 생물에서 만든 발견은 유비퀴틴 중재 저하의 보존 메커니즘에 중요한 통찰력을 지속적으로 제공 할 가능성이 높다.

대부분의 UPS 기판의 인식과 저하는 여러 단백질의 공동 작업이 필요합니다. 따라서, 주어진 불안정한 단백질의 조절 된 분해를 특징 짓는 중요한 목적은 단백질 분해에 대한 유전 적 요건을 결정하는 것이다. 효모 또는 포유 동물 세포에서 단백질 분해를 모니터링하기위한 고전 접근법 (예를 들어 펄스 – 체이스 및 사이클로 헥시 – 체이스 실험 27) 힘들고 시간 소모적이다. 이러한 유형의 방법은 단백질 분해를 검출하는 고감도 방법을 제공하지만, 이들은 단백질 분해 또는 대규모 screeni의 신속한 분석에 적합하지 않다단백질 분해를 방지 ng를 돌연변이. 여기에, 불안정한 단백질의 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 신속한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석은 제공됩니다.

단백질 분해,이자 (또는 저하 신호)의 불안정한 단백질을 분석하는 효모의 성장 기반 방법에서는 특정 상황에서 효모의 성장에 필요한 단백질, 프레임, 융합된다. 결과는 관심 불안정한 단백질의 단백질 분해의 유전 적 요구 사항을 결정하는 강력한 도구로서 작용할 수 인공 기판이다. 편리하게는, 가장 일반적으로 사용되는 실험실 효모 균주 특정 아미노산 또는 질소 함유 염기 (예 20,28-30)의 생합성에 관여하는 대사 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이 패널 항구. 이 효소는 합성 효소에 참여 외생 제공 대사의 부재하에 세포 증식에​​ 필수적이다. 이러한불안정한 단백질의 분해를위한 성장 기반 기자가 이들이 융합로서 대사 효소에 따라서 기능을 할 수있다. 단백질 분해를 방지 돌연변이가 저하 기자를 숨겨 세포가 선택적 조건에서 성장할 수 있도록하기 때문에 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항을 용이하게 설명 될 수있다.

성장 장점은 특정 돌연변이 관심 단백질 풍부 증가 간접 지표이다. 그러나 직접 생화학 적 분석은 돌연변이가 아니라 간접적 또는 인공적인 원인을 통해보다 증가 된 단백질 수준을 통해 성장을 허용하는지 확인해야합니다. 풍부한 단백질에 돌연변이의 효과는 않으며 특정 돌연변이를 정박하지 않는 세포에서의 정상 상태의 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 될 수있다. 적합한 형태 효모 단백질의 신속하고 효율적인 추출 (수산화 나트륨 및 샘플 완충액으로 효모 세포의 연속 배양) 미국 방법웨스턴 블롯 분석을 위해도 (31)를 제시한다. 함께, 이러한 실험은 단백질 분해의 후보 레귤레이터의 신속한 식별을 용이하게한다.

Protocol

단백질 분해에 결함이있는 후보 돌연변이를 확인하기 위해 1. 효모의 성장 분석 리포터 대사 효소로, 프레임에서 불안정한 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드와 야생형과 돌연변이 효모 세포를 형질. 플라스미드 분자를 보유하는 세포 합성을위한 선택적인 정의 (SD) 최소 배지 5ml에 형질 전환 체를 접종한다. 회전, 30 ° C에서 밤새 품어. 각 하룻밤 문화의 600 nm의 (OD 600)?…

Representative Results

이 방법을 설명하기 위해, HIS3 효소가 모델 소포체 (ER) -associated 저하의 카르복시 말단에 융합 된 (ERAD) 기판, Deg1 -Sec62 (그림 2A) Deg1 -Sec62-HIS3를 만들 수 있습니다 (그림 3) . Deg1 -Sec62는 translocon와 지속, 비정상적인 관계를 다음 타겟으로 ERAD 기판의 새로운 클래스의 창립 멤버이고, ER 막 32-34에서 단백질을 이동 주로 담당하는 채널입니다. 이러한 ?…

Discussion

여기에 제시된 방법론은 빠른 결정과 효모 세포에서 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 생화학 적 확인을 할 수 있습니다. 이 실험은 () (예 : 41 ~ 44을, 처리, 저장 및 효모 세포 조작을위한 프로토콜의 효모 생물학의 여러 우수 리뷰 및 컴파일 유기체에 새로운 연구자에 사용할 수있는) 유틸리티 및 전원 효모의 모델 진핵 생물 유기체 등을 강조 표시합니다. 기술은 용이하게 ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는지지하고 열정적 인 연구 환경을 제공하기 위해 루벤스 타인 실험실의 현재와 전 회원을 감사드립니다. 우리는 프로토콜 최적화에 도움 라이언 T. 깁슨 감사합니다. 우리는 효모 균주 및 플라스미드에 대한 마크 Hochstrasser (예일 대학)과 디터 늑대 (Universität의 슈투트가르트) 감사합니다. 우리는이 원고의 선명도와 유틸리티 개선에 도움을 준 익명의 검토를 부탁드립니다. 이 작품은 SGW에 시그마 사이의 볼 주립 대학의 장에서 연구 수상에 의해 지원되었다, 볼 주립 대학에서 국민 건강 보조금 연구소 (R15 GM111713) EMR에, EMR에 볼 주립 대학 바램이 연구 상, 자금 사무장의 사무실과 생물학과.

Materials

Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
Plate imaging system (e.g.
Gel Doc XR+ System)		 Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application
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References

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Citer Cet Article
Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).
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