Den mangesidede Fordele ved Protein Co-ekspression i<em> Escherichia coli</em

Summary

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Abstract

We report here that the expression of protein complexes in vivo de Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduction

Indførelsen af overekspression teknologier boostet enten biokemiske undersøgelser af lav kopital enzymer og industriel produktion af farmakologisk aktive proteiner (f.eks insulin). Siden indførelsen af ​​disse teknologier, har betydelige fremskridt er opnået at øge udbyttet og kvaliteten af ​​rekombinante proteiner. Derudover blev prokaryote ^1,2 og eukaryote ³ overekspression systemer udviklet i årenes løb, der tilbyder nyttige alternativer til "arbejdshest" af protein bioteknologi, dvs Escherichia coli. Især tilgængeligheden af alternative platforme til E. coli førte til produktion af rekombinante peptider eller proteiner, der bærer post-translationelle modifikationer. Det bør imidlertid nævnes, at E. coli repræsenterer stadig organismen valg for rekombinant proteinproduktion. Dette skyldes flere faktorer, blandt hvilke de mest relevante kan væreovervejes: i) adgang til en lang række overekspression systemer (ekspressionsvektorer og stammer) for E. coli ^1,2; ii) den korte generationstider og stor biomasse udbytter, E. coli i en række rige og syntetiske medier; iii) facile manipulation enten på biokemiske og på det genetiske niveau for denne mikroorganisme; iv) isolering af stammer i stand til produktion af toksiske proteiner ^4; v) opførelse af stammer featuring homogen induktion på populationsniveau ^5,6. Derudover blev det for nylig vist, at ekspressionssystemer er egnede til produktion i E. coli af posttranslationelt modificerede proteiner kan udtænkes og bygget ^2.

På nuværende tidspunkt er proteinoverekspression hovedsagelig anvendes til at opnå monomere eller homo-oligomere proteiner, hvis hypersynthesis kan udføres med et enkelt gen klonet ind i et passende plasmid. Men opmærksomhed var for nyligbetalt til opførelsen af E. coli protein co-ekspressionssystemer, udfordrende produktion in vivo af hetero-oligomere komplekser ^2. Interessant tidlige eksperimenter af protein co-ekspression behandlet mellem arterne samling af store og små underenheder af cyanobakteriel ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase / oxygenase ^7,8, og sammenslutningen af afkortede og fuld længde former af HIV-1 revers transkriptase ^9. Disse banebrydende studier viste, at protein co-ekspression er et effektivt alternativ til traditionelle in vitro rekonstitution. Desuden, protein co-ekspression i E. coli blev anvendt til at fremstille forskellige proteiner bærer posttranslationelle modifikationer ² til opnåelse af proteiner, der indeholder unaturlige aminosyrer ^2, og for at øge udbyttet af overudtrykte membranproteiner ^2. Desuden skal potentialet af protein co-ekspression som et redskab bibringer E. coli konkurrerernce i proteinsekretion er under aktiv efterforskning ^2.

To hovedstrategier af protein co-ekspression i E. coli kan forfølges: i) brug af et enkelt plasmid at være vært for forskellige gener, der skal overudtrykt; ii) anvendelse af multiple plasmider i enkelte celler at co-udtrykke målproteiner. I det første tilfælde gør kriterierne for valget af plasmidet ikke adskiller sig fra de traditionelle enkelt proteinoverekspression eksperimenter, selvom bestemte plasmider indeholdende tandem promotor / operator elementer blev konstrueret til co-ekspression ^10. Denne første fremgangsmåde er derfor ganske enkel. Det bør imidlertid nævnes, at anvendelsen af ​​et enkelt plasmid til at co-udtrykke forskellige proteiner står over for to store problemer: i) den molekylære masse af vektoren stiger med antallet af hostede gener, begrænser antallet af co-udtrykte proteiner; ii) når flere gener klones under kontrol af en enkelt promotor, polaritet kan decrease ekspressionen af ​​generne distalt fra promotoren. Brugen af dobbelte eller flere plasmider i single E. coli-celler har til at udføre foreneligheden af vektorer af valg, derfor pålægge begrænsninger for de støtteberettigede kombinationer af plasmider. Men denne anden co-ekspression strategi indeholder den fordel indeholder den molekylære masse af vektorer, og begrænser polaritet. Vi har for nylig bygget et protein co-ekspression, der er designet til at lette shuttling af gener mellem co-ekspressionsplasmider ^11. Især bygget vi pGOOD vektorer serien, de relevante funktioner, som er: i) en p15A replikationsstartområde, at give forenelighed pGOOD plasmider med de kommercielle vektorer indeholdende ColE1 (f.eks pBAD serie ^12); ii) et tetracyclin-resistens-kassette; iii) tilstedeværelsen af lac-afledt regulerende elementer, dvs. Ophavsmanden-operatør (O ₁₎ par og lacl </em> ^q-gen. Ved hjælp af en passende pBAD-pGOOD par, var vi i stand til at overudtrykke den katalytiske kerne af E. coli DNA-polymerase III, som består af tre forskellige underenheder, dvs. α (5'-3 'polymerase), ε (3'-5' exonuclease) og θ (stabiliserende ε) ^13. Vi har navnlig vist, at co-ekspression af αεθ komplekset var strengt afhængig af tilføjelsen til E. coli dyrkningsmedium både IPTG og arabinose, udløser overekspression fra pGOOD og pBAD, (figur 1A).

I nærværende rapport, illustrerer vi, hvordan protein co-ekspression effektivt kan løse problemer i forbindelse med ringe opløselighed af et protein kompleks underenhed. Desuden viser vi, hvordan in vivo protein komplementeringsgrupper tests kan udføres, og vi endelig rapport om anvendelsen af protein co-ekspression at tune mutationsfrekvens i E. coli. Til dette formål anvendte vi pGOOD-pBAD par egnede til at illustrere relevante eksempler på hver casestudie.

Protocol

1. Isolering af E. coli Co-transformanter Forbered elektro-kompetente celler af den passende E. coli-stamme, der skal transformeres. Overførsel til 1 ml LB-medium (trypton, gærekstrakt, NaCI ved 10, 5 og 10 g / l) en enkelt koloni af stammen af ​​valg, og inkuberes ved 37 ° C under rystning betingelser på 180 rpm. Fortynd præ-kultur 1: 500 i 25 ml frisk LB-medium og inkuberes kulturen ved 37 ° C. Ved log-fase (0,6 OD) centrifugeres cellerne suspensionen ved 5.000 xg i 20 …

Representative Results

Den ε-underenheden af E. coli DNA-polymerase III består af 243 aminosyrer og har ringe opløselighed 17,18, medmindre resterne 187-243 slettes 17. Imidlertid har vi tidligere vist, 11 at co-ekspression af fuld længde α, ε og θ underenheder giver opløseligt DNA-polymerase III katalytisk kerne (Figur 1). Især ved anvendelse af pBAD-pGOOD co-ekspressionssystem, vi påvist, at: i) kan overekspression af α og ε underenheder styres uafhængigt af arabinose o…

Discussion

Proteiner kan være uløseligt uorganiseret, og byder på regioner, hvis tertiære struktur er ikke begrænset til et begrænset antal konformationer ^25. Disse uordnede proteiner er normalt tilbøjelige til aggregering ²⁵ og deres isolering og karakterisering kan udgøre en vanskelig opgave. Den ε-underenheden af E. coli DNA-polymerase III er udstyret med to adskilte domæner ^26,27, nemlig: i) N-ter domæne, der er forsynet med 3'-5'-exonukleaseaktivitet, og kompetent i…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix