As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em> Escherichia coli</em

Summary

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Abstract

We report here that the expression of protein complexes in vivo de Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduction

A introdução de tecnologias superexpressão potenciado quer os estudos bioquímicos de baixo número de cópias enzimas Número e a produção industrial de proteínas farmacologicamente activas (por exemplo, insulina). Desde o advento das tecnologias, avanços significativos foram conseguidos para aumentar o rendimento e a qualidade de proteínas recombinantes. Além disso, ^1,2 procariotas e eucariotas ³ sistemas superexpressão foram desenvolvidos ao longo dos anos, oferecendo alternativas úteis para o "cavalo de trabalho" da biotecnologia proteína, ou seja, Escherichia coli. Em particular, a disponibilidade de plataformas alternativas para E. coli levou à produção de péptidos recombinantes ou proteínas de rolamento modificações pós-traducionais. No entanto, deve ser mencionado que a E. coli ainda representa o organismo de eleição para a produção de proteína recombinante. Isso se deve a vários fatores, entre os quais o mais relevante pode serconsiderado: i) a disponibilidade de um grande número de sistemas de sobre-expressão (vectores de expressão e estirpes) para E. coli ^1,2; ii) vezes a curto geração e de alto rendimento de biomassa, de E. coli em uma variedade de mídia rica e sintética; iii) a manipulação fácil, quer a bioquímica e genética ao nível deste microrganismo; iv) o isolamento das estirpes capazes de produção de proteínas tóxicas ^4; v) a construção de cepas que caracterizam indução homogênea a nível da população ^5,6. Além disso, demonstrou-se recentemente que os sistemas de expressão adequados para a produção em E. coli de proteínas modificadas pós-tradução podem ser concebidos e construídos ^2.

Actualmente, a sobre-expressão da proteína é utilizada, principalmente, para obter proteínas monoméricas ou homo-oligoméricas, cuja hypersynthesis pode ser realizado com um único gene clonado num plasmídeo adequado. No entanto, a atenção foi recentementepago para a construção de E. sistemas de proteína co-expressão de E. coli, desafiando a produção, in vivo, de complexos hetero-oligomérica ^2. Curiosamente, os primeiros experimentos de proteína co-expressão se dirigiu à assembléia inter-espécies de grandes e pequenas subunidades de carboxylase cianobactérias ribulose-1,5-bisfosfato / oxigenase ^7,8, ea associação de formas truncadas e de corpo inteiro de HIV-1 transcriptase reversa ^9. Estes estudos pioneiros demonstrado que a co-expressão da proteína representa uma poderosa alternativa ao tradicional na reconstituição in vitro. Além disso, a proteína co-expressão em E. coli foi utilizado para produzir diferentes proteínas que ostentam modificações pós-traducionais ^2, para se obter proteínas que contêm aminoácidos não naturais ^2, e para aumentar o rendimento de proteínas de membrana overexpressed ^2. Além disso, o potencial de co-expressão da proteína como uma ferramenta para conferir a E. coli competirnce na secreção de proteínas está sob investigação ativa ^2.

Duas estratégias principais de co-expressão da proteína em E. coli pode ser prosseguido: i) o uso de um único plasmídeo para receber os diferentes genes a ser sobre-expresso; ii) a utilização de vários plasmídeos em células individuais para co-expressar as proteínas alvo. No primeiro caso, os critérios para a escolha do plasmídeo não diferem dos de experiências individuais tradicionais sobre-expressão da proteína, embora determinados plasmídeos contendo em tandem os elementos promotor / operador foram construídos para co-expressão ^{de 10.} Esta primeira abordagem é, portanto, bastante simples. No entanto, deve mencionar-se que o uso de um único plasmídeo de co-expressar proteínas diferentes enfrenta dois grandes problemas: i) a massa molecular do vector aumenta com o número de genes que alberguem, limitando o número de proteínas co-expressas; ii) quando vários genes foram clonados sob o controlo de um único promotor, de polaridade pode decreasum e a expressão dos genes distais do promotor. O uso de plasmídeos duplos ou múltiplos no único E. células de E. coli tem de realizar o grau de compatibilidade dos vectores de escolha, por conseguinte, a imposição de restrições para as combinações de plasmídeos elegíveis. No entanto, esta segunda estratégia de co-expressão apresenta a vantagem de conter a massa molecular de vectores, e limita polaridade. Construiu-se, recentemente, um sistema de co-expressão de proteínas concebido para facilitar o vaivém de genes entre os plasmídeos de co-expressão de ^11. Em particular, nós construídos vectores da série pGOOD, as características relevantes dos quais são os seguintes: i) uma origem de replicação de p15A, para proporcionar a compatibilidade dos plasmídeos pGOOD com os vectores comerciais contendo a origem ColE1 (por exemplo, a série de pBAD ^12); ii) uma cassete de resistência à tetraciclina; iii) a presença de lac -derived elementos reguladores, ou seja, o promotor-operador (O ₁₎ casal eo lacI </em> gene ^q. Usando um par pBAD-pGOOD disso, fomos capazes de overexpress o núcleo catalítico de E. coli ADN polimerase III, composto por três subunidades diferentes, ou seja, α (5'-3 'da polimerase), ε (3'-5' exonuclease) e θ (estabilizador ε) ^13. Em particular, foi demonstrado que a co-expressão do complexo αεθ era estritamente dependente da adição à E. coli meio de cultura de ambos IPTG e arabinose, provocando a sobre-expressão de pBAD pGOOD e, respectivamente (Figura 1A).

No presente relatório, que ilustram como proteína co-expressão pode eficientemente resolver dificuldades relacionadas com a baixa solubilidade de uma proteína subunidade complexo. Além disso, mostramos como em testes de complementação de proteína vivo pode ser realizada, e, finalmente, um relatório sobre a utilização de proteínas co-expressão a frequência de mutação sintonizar E. coleu. Para tal, utilizou-se casais pGOOD-pBAD adequados para ilustrar exemplos relevantes de cada estudo de caso.

Protocol

1. Isolamento de E. coli co-transformantes Prepare células eletro-competente do E. apropriado coli estirpe a ser transformada. Transferência para 1 ml de meio LB (triptona, extracto de levedura, NaCl a 10, 5 e 10 g / L, respectivamente) de uma única colónia da estirpe de escolha, e incubar a 37 ° C sob condições de agitação de 180 rpm. Dilui-se a pré-cultura de 1: 500 em 25 ml de meio LB fresco e incuba-se a cultura a 37 ° C. Na fase de log (0,6 OD) centrifugar …

Representative Results

A subunidade de E. ε coli DNA polimerase III é composto por 243 aminoácidos e possui baixa solubilidade em 17,18, a menos que os resíduos 187-243 são eliminados 17. Contudo, mostrámos previamente 11 que o co-expressão de α de comprimento completo, ε, e subunidades θ produz DNA polimerase III solúvel do núcleo catalítico (Figura 1). Em particular, usando o sistema de pBAD-pGOOD co-expressão, demonstramos que: i) a sobre-expressão de subuni…

Discussion

As proteínas podem ser intrinsecamente desordenados, caracteriza regiões cuja estrutura terciária não está restrita a um número limitado de conformações ^25. Estas proteínas são geralmente desordenados propensos a agregação de ^25, e o seu isolamento e caracterização pode representar uma tarefa difícil. A subunidade de E. ε DNA polimerase III coli apresenta dois domínios distintos ^26,27, a saber: i) o domínio N-ter, tendo o 'exonuclease 3'-5, e c…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix