Det mångfacetterade Fördelar med Protein Samexpression i<em> Escherichia coli</em

Summary

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Abstract

We report here that the expression of protein complexes in vivo de Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduction

Införandet av överuttryck teknik ökas antingen de biokemiska studier av låg-kopietal enzymer och industriell produktion av farmakologiskt aktiva proteiner (t.ex. insulin). Sedan tillkomsten av dessa tekniker, har betydande framsteg gjorts för att öka avkastningen och kvaliteten av rekombinanta proteiner. Dessutom var prokaryota ^1,2 och eukaryota ³ överuttryck system utvecklats under åren, som erbjuder användbara alternativ till "arbetshäst" av protein bioteknik, dvs Escherichia coli. I synnerhet tillgången till alternativa plattformar till E. coli ledde till produktion av rekombinanta peptider eller proteiner som bär post-translationella modifieringar. Det bör dock nämnas att E. coli representerar fortfarande organismen i valet för rekombinant proteinproduktion. Detta beror på flera faktorer, bland vilka de mest relevanta kan varabeaktas: i) tillgången till ett stort antal överuttryck system (expressionsvektorer och stammar) för E. coli ^1,2; ii) den korta generationstider och hög avkastning biomassa, av E. coli i en mängd rik och syntetiska medier; iii) facile manipulering antingen på den biokemiska och på genetisk nivå av denna mikroorganism; iv) isolering av stammar som kan produktion av toxiska proteiner ^4; v) byggandet av stammar terar homogen induktion på befolkningsnivå ^5,6. Dessutom har nyligen visat att uttryckssystem lämpliga för framställning i E. coli av post-translation modifierade proteiner kan utformas och konstrueras ^2.

För närvarande, är proteinuttryck används främst för att erhålla monomera eller homo-oligomera proteiner, vilkas hypersynthesis kan utföras med en enda gen klonas in i en lämplig plasmid. Men uppmärksamhet var nyligenbetalas till byggandet av E. coli protein co-expressionssystem, utmanande produktion, in vivo, av hetero-oligomera komplex ^2. Intressant, tidiga experiment protein samtidigt uttryck tog upp mellan djurarter montering av stora och små subenheter av cyanobakterier ribulos-1,5-bisfosfatkarboxylas / oxigenas ^7,8, och föreningen av stympade och fullängds former av HIV-1 omvänt transkriptas ^9. Dessa banbrytande studier visade att protein samuttryckning utgör ett kraftfullt alternativ till traditionella in vitro beredning. Dessutom protein samuttryck i E. coli användes för att producera olika proteiner som bär post-translationella modifieringar ^2, för att erhålla proteiner innehållande onaturliga aminosyror ^2, och för att öka utbytet av överuttryckta membranproteiner ^2. Dessutom, för att den potential som protein samuttryckning som verktyg ge till E. coli tävlaIOU i proteinutsöndring är under aktiv utredning ^2.

Två huvudstrategier för protein samtidigt uttryck i E. coli kan eftersträvas: i) användandet av en enda plasmid som värd för olika gener som ska överuttryckt; ii) användningen av multipla plasmider i enstaka celler att samuttrycka målproteinerna. I det första fallet, gör kriterierna för valet av plasmiden inte skiljer sig från traditionella enkla proteinöveruttryck experiment, även om vissa plasmider innehåller tandem promotor / operatörselement byggdes för samtidigt uttryck ^10. Denna första metoden är därför ganska enkelt. Det bör dock nämnas att användningen av en enda plasmid att co-uttrycka olika proteiner står inför två stora svårigheter: i) molekylvikt av vektor ökar med antalet av värd gener, begränsar antalet samuttryckta proteinerna; ii) när multipla gener klonas under kontroll av en enda promotor, polaritet kan decrease expressionen av generna distala från promotorn. Användningen av dubbla eller multipla plasmider i enstaka E. coli-celler måste åstadkomma förenlighet vektor av val, därför införa begränsningar för de stödberättigade kombinationer av plasmider. Emellertid, denna andra samexpression strategin finns den fördelen innehållande molekylmassan för vektorer, och begränsar polaritet. Vi konstruerade nyligen en protein co-expressionssystem för att underlätta skytt av gener mellan co-expressionsplasmidema ^11. Särskilt konstruerade vi pGOOD vektor serien, de relevanta delarna av dessa är: i) en p15A replikationsstart, för att ge kompatibilitet av pGOOD plasmider med de kommersiella vektorer som innehåller ursprunget ColE1 (t.ex. pBAD serien ^12); ii) en tetracyklinresistens kassetten; iii) förekomsten av lac-härledda regulatoriska element, dvs Promotorn-Operator (O ₁₎ par och lacl </em> ^q-genen. Använda en lämplig pBAD-pGOOD par, kunde vi överuttrycker den katalytiska kärnan i E. coli DNA-polymeras III, som består av tre olika subenheter, dvs α (5'-3 'polymeras), ε (3'-5' exonukleas) och θ (stabiliserande ε) ^13. I synnerhet visade vi att samuttrycket av αεθ komplexet var strikt beroende av tillägg till E. coli-odlingsmedium av både IPTG och arabinos, utlöser överuttryck från pGOOD och pBAD, respektive (Figur 1A).

I denna rapport, visar vi hur protein samtidigt uttryck effektivt kan lösa problem som är kopplade till den dåliga lösligheten av ett proteinkomplex subenhet. Dessutom visar vi hur in vivo proteinkompletterings tester kan utföras, och vi slutligen rapportera om användningen av protein samexpression att avstämma mutationsfrekvensen i E. coli. För detta syfte använde vi pGOOD-pBAD par lämpliga för att illustrera relevanta exempel på varje fallstudie.

Protocol

1. Isolering av E. coli Co-transformanter Förbered elektro behöriga celler av lämplig E. coli-stammen som skall transformeras. Överföring till 1 ml av LB-medium (trypton, jästextrakt, NaCl vid 10, 5 och 10 g / L, respektive) en enda koloni av stammen enligt val, och inkubera vid 37 ° C under skakning förhållanden 180 rpm. Späd förkulturen 1: 500 i 25 ml färskt LB-medium och inkubera kulturen vid 37 ° C. Vid log-fas (0,6 OD) Centrifugera cellerna suspensionen vid 5000 x…

Representative Results

Den ε subenheten av E. coli DNA-polymeras III består av 243 aminosyror och har dålig löslighet 17,18, om inte resterna 187-243 raderas 17. Vi har dock tidigare visat 11 att samtidigt uttryck av fullängds α, ε, och θ subenheter ger lösligt DNA-polymeras III katalytisk kärna (Figur 1). I synnerhet, med pBAD-pGOOD sam-expressionssystem visade vi att: i) kan överuttryck av α och ε subenheter oberoende kontrolleras av arabinos och IPTG, respektive <stron…

Discussion

Proteiner kan vara inneboende oordnad, med regioner som tertiär struktur är inte begränsad till ett begränsat antal konformationer ^25. Dessa oordnade proteiner är oftast utsatta för aggregering ^25, och deras isolering och karakterisering kan utgöra en svår uppgift. Den ε subenheten av E. coli DNA-polymeras III har två distinkta domäner ^26,27, nämligen: i) N-ter-domän, med 3'-5 'exonukleasaktivitet och kompetent i bindning av θ subenheten; ii) C-ter-domänen…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix