<em> Ex vivo</em> דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם
Summary
פיתחנו מודל vivo לשעבר רומן ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. היא מבוססת על microstructures הרקמה מבודדת מדגימות רקמת שד ניתוחיות המשמרות מבנה רקמה, אינטראקציות בין תאית, ואיתות אוטוקריני.
Abstract
מחקר פעולה של הורמונים בשד האנושי כבר הקשו על ידי היעדר מערכות מודל הולמים. על התרבות במבחנה, תאי אפיתל החלב ראשוניים נוטים לאבד ביטוי קולט הורמון. נרחב שורות תאי סרטן השד חיובי קולט הורמון המשמשות הן רלוונטיות מוגבלות למצב in vivo. כאן אנו מתארים מודל vivo לשעבר ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. דגימות טריות אנושיות רקמת שד מחומר שנזרק כירורגית כגון mammoplasties הפחתה או mammectomies הם מכניים ואנזימים מתעכלים להשיג שברי רקמה המכילים צינוריות ואוניות וסוגים שונים של תאי סטרומה. microstructures הרקמות אלה המשיכו במדיום בסיסי ללא גורמי גדילה לשמר הקשר בין תאיתם, מבנה הרקמה, ולהישאר הורמון מגיב במשך כמה ימים. הם מעובדים בקלות לRNA ומיצוי חלבון, ניתוח היסטולוגית או מאוחסנים בהקפאה בינונית. הקרינהמיון תא פעיל (FACS) ניתן להשתמש כדי להעשיר לאוכלוסיות תאים ספציפיות. פרוטוקול זה מספק גישה פשוטה, סטנדרטית ללימודי translational עם דגימות מורכבות ביותר, מגוונות אנושיות.
Introduction
מידע על נוף מוטאציות בסרטן השד גדל בקצב מהיר. פחות תשומת לב הוקדשה לגורמים מערכתיים המשפיעים על התפתחות סרטן השד. חשיפה להורמוני רבייה יש השפעה משמעותית על התקדמות מחלה 1-3. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם הורמוני רבייה לפגוע בשד האנושי הם הבינו היטב. עבודה עם מודלים של עכברים מהונדסים גנטי גילתה כי הם כרוכים איתות פנימית ואוטוקריני תא באמצעות מספר effectors במורד הזרם 4.
הידע המוגבל על פעולת הורמונים בשד האנושי הוא במידה רבה מיוחס לחוסר מודלים נאותים. רוב העבודה על המנגנונים של קולטן אסטרוגן (ER) וקולטני פרוגסטרון איתות (PR) שבוצעה עם קווי קולט הורמון חיוביים סרטן שד תא, כגון MCF-7 וT47D. אלה נגזרים מיפליטו פלאורלי מחולים עם סרטן השד מתקדם שהיה לי already קיבל טיפולים מרובים 5. רלוונטי הביולוגית של ממצאים במבחנת מודלים פשוטים כל כך של השד האנושי הוא גנים מפוקפקים ויעד שזוהו במודלים אלה במבחנה הם שונים מגני היעד שמזוהים במודלים של בעלי חיים 6. כאשר תאי אפיתל שד אנושי ראשוני בתרבית במבחנה הם נוטים לאבד את ביטוי קולט הורמון ולכן תגובת הורמון 7,8. בעיה זו ניתן circumventd על ידי גישות 3D מתוחכמות באמצעות matrigel. בדרך זו, סי קלארק ועמיתים הצליחו להקים תאי האפיתל שד שנשמרו ביטוי קולט הורמון והראה תגובת שגשוג לפרוגסטרון גירוי 9. ובכל זאת, שתי חשובים בגנים המטרה קולטני פרוגסטרון vivo, Wnt-4 וRANKL, לא נגרם על גירוי פרוגסטרון במערכת זו 9. גישה זו צולמה לאחרונה על עוד עם במבחנה </em> טיפול מקדים הורמון ואינדוקצית RANKL הושג 10. אזהרה היא שיש matrigel פעילויות שהן אצווה תלויות, היא יקר, ודורשת תכנון ניסוי כי הוא מתאים למספרים סלולריים קטנים בלבד.
בהתבסס על הממצא שבER vivo ואיתות יחסי הציבור מתווכים במידה רבה על ידי אינטראקציות אוטוקריני 11, אנחנו טענו שאינטראקציות בין תאית צריכה להישמר. גורם חשוב נוסף שהולך לאיבוד כרקמות הם ניתקו לתאים בודדים לתרבות במבחנה הן האינטראקציות של תאי האפיתל במטריצה תאית; אך אלה הם קריטיים לבידול אפיתל ושיבושם חשוב ביצירת גידולים 12. עם זה בחשבון, הקמנו שיטה לבודד microstructures רקמת שד מחומר שנזרק כירורגית טרי 13. Parenchyma השד, בהיקף של אפיתל שני שכבות עם luminal הפנימי וחיצוני myoepitheliתאי אל, הוא גזורים מרקמת שומן ונתונים לניתוק מכאני והאנזימטית. לאחר הכביסה וצנטריפוגה, שברי צינורות החלב מתקבלים ששומרים אינטראקציות קרובות עם הרבה תאי סטרומה. microstructures רקמות אלה יישאר הורמון תגובה. המודל היה תוקף בדגימות קליניות 13. ככזה, ההליך הנוכחי יכול לעזור ללמוד פעולת הורמון בשד בהקשר ביולוגי ורלוונטי מבחינה קלינית.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרבות vivo לשעבר המתוארת כאן מספקת microstructures רקמת שד המכילה צינורות שלמים ואוניות, יחד עם סוגי תאים אחרים בדרך כלל נמצאים בחזה הנשי האנושי. בעיבוד של רקמת השד האנושית בדרך כלל מתקבלת מmammoplasties ההפחתה, הסרת רקמת שומן, עיכול מכאני והאנזימטית של מטריצת סטרומה, ותמוגה של …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים M. Fiche של בית החולים של האוניברסיטה של לוזאן למתן תמונת מאמופלסטית, מ 'וא' וירט Ayyanan של שוויצרי מכון לחקר הסרטן ניסויי, המרכז הלאומי של יכולת המחקר המולקולרית אונקולוגיה, בית הספר למדעי חיים, אקול פוליטכניק הפדרלי דה לוזאן לקבלת סיוע טכני ור 'קלארק מאוניברסיטת מנצ'סטר להערות ביקורתיות. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל תמיכה מSNF3100A0-112090, Oncosuisse 531,817, ותרופות היוזמה המשותפת ההתחייבות החדשנית תחת הסכם מענק לא. 115,188, משאבים אשר מורכבים מתרומה כספית מהתכנית של האיחוד האירופי מסגרת השביעית (FP7 / 2007-2013) ופדרציה האירופית של חברות תעשיות פרמצבטיות ועמותות 'בתרומה נדיבה. כתובת האינטרנט של תרופות חדשניות יוזמה היא http://www.imi.europa.eu/. </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
- Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
- MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
- Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. ‘Hormonal’ risk factors, ‘breast tissue age’ and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
- Brisken, C., O’Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
- Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
- Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
- Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
- Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
- Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
- Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
- Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
- Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
- Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).
