Una<em> Ex vivo</em> Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano
Summary
Hemos desarrollado un nuevo modelo ex vivo para estudiar la acción de la hormona en el pecho humano. Se basa en microestructuras de tejido aisladas a partir de muestras de tejido de mama quirúrgicos que conservan la arquitectura del tejido, las interacciones intercelulares, y la señalización paracrina.
Abstract
El estudio de la acción de la hormona en el pecho humano se ha visto obstaculizada por la falta de sistemas de modelos adecuados. Tras el cultivo in vitro, las células epiteliales mamarias primarias tienden a perder la expresión del receptor de la hormona. Ampliamente receptor de la hormona líneas celulares de cáncer de mama positivo utilizados son de limitada relevancia para la situación in vivo. A continuación, describimos un modelo ex vivo para estudiar la acción de la hormona en el pecho humano. Muestras de tejido de mama humanos frescos a partir de material de descarte quirúrgica como mammoplasties reducción o mammectomies están mecánica y enzimáticamente digeridos para obtener fragmentos de tejidos que contienen conductos y los lobulillos y los múltiples tipos de células del estroma. Estas microestructuras de tejido mantenidas en medio basal sin factores de crecimiento conservan sus contactos intercelulares, la arquitectura de los tejidos, y siguen siendo sensible a hormonas durante varios días. Se procesan fácilmente para ARN y la extracción de proteínas, el análisis histológico o almacenadas en medio de congelación. Fluorescenciaclasificación de células activadas (FACS) puede usarse para enriquecer poblaciones de células específicas. Este protocolo proporciona un enfoque sencillo, estándar para estudios traslacionales con, variados especímenes humanos altamente complejos.
Introduction
Información sobre el paisaje mutacional en el cáncer de mama está aumentando a ritmo rápido. Se ha prestado menos atención a los factores sistémicos que influyen en el desarrollo del cáncer de mama. La exposición a las hormonas reproductivas tiene un impacto importante en la progresión de la enfermedad 1-3. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las hormonas reproductivas inciden en el pecho humano, son poco conocidos. Trabajar con modelos de ratones genéticamente modificados ha revelado que implican células de señalización intrínseca y paracrina través de varios efectores 4.
El conocimiento limitado acerca de la acción de la hormona en el pecho humano es atribuible en gran medida a la falta de modelos adecuados. La mayoría del trabajo sobre los mecanismos de receptor de estrógeno (ER) y receptor de progesterona de señalización (PR) se ha realizado con receptores hormonales positivos líneas celulares de cáncer de mama, tales como MCF-7 y T47D. Estos se derivan de los derrames pleurales de pacientes con cáncer de mama avanzado que tenía already recibió múltiples tratamientos 5. La importancia biológica de los resultados en este tipo de modelos simples in vitro de la mama humana es genes cuestionables y destinatarios identificados en estos modelos in vitro son difieren de los genes diana que se identifican en modelos animales 6. Cuando las células epiteliales de mama humano primario se cultivan in vitro tienden a perder la expresión del receptor de la hormona y por lo tanto la respuesta de la hormona 7,8. Este problema puede ser circumventd por enfoques sofisticados 3D utilizando matrigel. De esta manera, C. Clarke y sus colegas tuvieron éxito en el establecimiento de las células epiteliales de mama que mantenían la expresión del receptor de la hormona y mostraron una respuesta proliferativa a la estimulación de progesterona 9. Sin embargo, dos importantes in vivo genes diana de receptores de progesterona, Wnt-4 y RANKL, no fueron inducidos a la estimulación de progesterona en este sistema 9. Este enfoque fue recientemente tomada en más con in vitro </em> pretratamiento hormonal y RANKL inducción se logró 10. Una advertencia permanece matrigel que tiene actividades que son dependientes de lotes, es caro, y exige un diseño experimental que es apto para sólo el número de células pequeñas.
Sobre la base de la constatación de que en ER vivo y PR de señalización están en gran parte mediada por interacciones paracrinas 11, argumentamos que las interacciones intercelulares deben ser mantenidos. Otro factor importante que se pierde como tejidos se disocian a las células individuales para el cultivo in vitro son las interacciones de las células epiteliales con la matriz extracelular; sin embargo, éstos son críticos para la diferenciación del epitelio y su alteración es importante en la tumorigénesis 12. Con esto en mente, hemos establecido un método para aislar microestructuras de tejido de mama a partir de material de descarte quirúrgica fresco 13. El parénquima mamario, que consiste en un epitelio de dos capas con luminal interior y exterior myoepithelicélulas de Al, se diseca lejos de tejido adiposo y se someten a la disociación mecánica y enzimática. Después del lavado y centrifugación, se obtienen fragmentos de conductos de la leche que mantienen una estrecha interacción con muchas células del estroma. Estas microestructuras de tejido permanecen hormona sensible. El modelo fue validado en muestras clínicas 13. Como tal, el presente procedimiento puede ayudar a estudiar la acción hormonal en la mama en un contexto biológicamente y clínicamente relevante.
Protocol
Representative Results
Discussion
El cultivo ex vivo descrito aquí proporciona microestructuras de tejido de mama que contienen conductos y lóbulos intactos, junto con otros tipos de células que se encuentran normalmente en el pecho femenino humano. En el procesamiento del tejido de mama humano generalmente obtenido a partir de mammoplasties de reducción, la eliminación de tejido adiposo, la digestión mecánica y enzimática de la matriz estromal, y la lisis de las células rojas de la sangre enriquece para los fragmentos conducto de lech…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a M. Ficha del Hospital Universitario de Lausana para proporcionar la fotografía mamoplastia, M. Wirth y A. Ayyanan del Instituto Suizo de Investigación Experimental del Cáncer, Centro Nacional de Competencia en Investigación de Oncología Molecular, Facultad de Ciencias de la Vida, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausana para la asistencia técnica y R. Clarke, de la Universidad de Manchester para comentarios críticos. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido el apoyo de SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, y la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores empresa común en virtud del acuerdo de subvención no. 115.188, los recursos de los cuales se compone de contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7 / 2007-2013) y la Federación Europea de Industrias y Asociaciones Farmacéuticas empresas »de la aportación no dineraria. La dirección Web de la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores es http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
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