Upptäckt av Exosomal Biomarker från Electric Field-inducerad Release och värdering (EFIRM)

Summary

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Abstract

Exosomes är microvesicular strukturer som spelar en medlande roll i kommunikationen mellan. Det är av intresse att studera den interna last av exosomes att avgöra om de bär sjukdoms diskriminerande biomarkörer. För att utföra exosomal analys är det nödvändigt att utveckla en metod för att utvinna och analysera exosomes från målgrupp Biofluids utan att skada den interna innehåll.

Elektriskt fält-inducerad frisättning och mätning (EFIRM) är en metod för att specifikt extrahera exosomes från Biofluids, lossning deras last, och testa deras interna halt RNA / protein. Använda en anti-human CD63 specifik antikropp magnetiska mikropartikel är exosomes först ut från Biofluids. Efter utvinning, lågspänning elektriska cykliska fyrkantsvågor (CSW) tillämpas för att störa vesikulär membran och orsaka last lossning. Innehållet i Exosome hybridiseras till DNA-primers eller antikroppar immobiliserade på en elektrodyta för quantification av molekylär innehåll.

Den EFIRM Metoden är fördelaktig för utvinning av exosomes och lossning för analys utan lysbuffert. Denna metod är kapabel att utföra specifik detektion av både RNA och protein biomarkörer mål i Exosome. EFIRM extraherar exosomes specifikt utifrån deras ytmarkörer i motsats till storleksbaserade tekniker.

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) och analysen demonstrerar funktionaliteten av metoden för Exosome avskiljning och analys. Den EFIRM Metoden tillämpades på exosomal analys av nio möss som injicerats med humana lungcancer H640-celler (en cellinje transfekterad för att uttrycka Exosome markör humant CD63-GFP) i syfte att testa deras Exosome profil mot 11 möss som erhöll saltlösningskontroller. Förhöjda nivåer av exosomal biomarkörer (referens gen GAPDH och proteinytan markör mänskligt CD63-GFP) påträffades för H640 injicerade möss i både serum och salivprov. Vidare saliva och serumprover visat sig ha linjäritet (R = 0,79). Dessa resultat tyder på livskraft spott Exosome biomarkörer för detektion av distala sjukdomar.

Introduction

Exosome forskningen är en framväxande området utredning som undersöker lipid mikrovesiklar som bär RNA ^1, DNA ^2, och protein ³ last. Tidigare undersökningar av Exosome biologi har lett till identifiering av exosomer i Biofluids såsom blod ^4, urin ^5, bröstmjölk ^6, och saliv ^7. Studier har visat att exosomer spela en roll i olika cellulära vägar, distans medi kommunikation mellan olika system i kroppen ^8. På grund av den roll exosomer spela i kommunikationen mellan, är det en hypotes om att de kan paketera biomolekyler mål (protein, RNA, och DNA) korrelerade med sjukdomstillstånd. In vitro ³ och djurmodell ⁹ studier tycks bekräfta denna hypotes. Vid utredning exosomal innehåll för upptäckt av biomarkörer, är det nödvändigt att utveckla en metod för selektiv Exosome isolering från Biofluids, framkallad expulsipå av last från exosomer, och kvantifiering av Exosome biomolekyler. I omfattningen av detta arbete kommer exosomes definieras som en struktur med en diameter på ca 70-100 nm och som har ytmarkör CD63.

Forskare vanligtvis först rena exosomes genom ultracentrifuge ¹⁰ och sedan bearbeta exosomal innehåll genom användandet av lys buffert kit. Användning lysbuffert metoder kräver inkubationstider som sträcker sig från minuter till timmar. Denna process kan potentiellt skada Exosome last och leda till prov nedbrytning. Till exempel, spott Exosome RNA frigöras via lysbuffert till den omgivande extracellulära miljön besitter en halveringstid på mindre än en minut, vilket gör mätningen av exosomal RNA efter lysbuffert en särskilt svår uppgift utan tillsats av stabiliseringsreagens ^11. Den sammansatta effekten av att tillsätta olika reagenser för lys och stabilisering får införa agenter som komplicerar och störa analysis av exosomal innehåll. Ett alternativt tillvägagångssätt kan vara till hjälp för att snabbt lossning exosomal innehåll och säkert bevara lasten för karakterisering.

I detta arbete föreslår vi användning av en icke-enhetlig elektriskt fält för frisläppandet av exosomal innehåll. Elektriska fält har varit kända för att bära förmåga att polarisera och störa lipiddubbelskiktet som bildar cellmembran. Vår experimentella arbetet utforskar användningen av icke-enhetliga cykliska fyrkantsvågor (CSW) för att störa mikrovesikel struktur exosomes och släppa transporteras gods. Denna metod använder spänningar i flera hundra millivolt intervall, vilket innebär att de flesta biomolekyler inte kommer att störas. Vi visar att användningen av en cyklisk-fyrkantvåg är kunna påverka frisättning av saliv Exosome mRNA innehållet i den omgivande fluidmiljön. Den här versionen av exosomal innehåll är sömlöst integrerad med ett elektrodsystem som kan användas för att kvantifiera biomarkör expressionsnivåer ^12,13. Denna föreslagna metoden möjliggör snabb, känslig och lysisbuffert fri analys av Exosome innehåll.

Figur 1. Översikt över EFIRM ^Workflow.. Är EFIRM metoden grovt delas in i tre huvudfaser som är nödvändiga för rening och analys exosomes.

Denna CSW baserad exosomal innehålls release och analysmetod används tillsammans med CD63-specifika magnetiska mikrokulor för Exosome isolering. Dessa CD63-affinitetspärlor möjliggöra selektiv isolering av exosomer från spottprov (och andra Biofluids). Efter inkubation och utvinning av exosomes hjälp av magnetiserade pärlor, är pärlorna migreras till den elektrokemiska sensorsystem för CSW baserat innehåll frigivning och analys delen av experimentet. Figur 1 ger en översikt av arbetetflöde av EFIRM metoden.

Protocol

1. Magnetisk Bead-baserade Exosome Extraktion Pipettera en väl blandad lösning av 5 | il streptavidinbelagda magnetiska mikropartiklar i 495 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert i ett mikrocentrifugrör för att återsuspendera pärlorna. Tvätta och resuspendera kulorna med 500 l PBS tre gånger med hjälp av en magnetisk rack. Kuggstången är en array av magneter på den sida av en bostadsenhet, som kan hålla provet mikrocentrifugrör. För varje tvätt, låt först rören sitta på ra…

Representative Results

Validering av Exosome Capture av pärlor Använda TEM Isolering av exosomer från saliv som använder anti humana CD63 magnetiska kulor validerades efter extraktion protokollet genom att använda transmissionselektronmikroskop (TEM) bilder. TEM visar magnetiska pärlor med 70-100 nm granulat omedelbart intill (se figur 3A och 3B), i överensstämmelse med den kända profilen exosomes. Inga 70-100 nm granulat observerades för de magnetiska p…

Discussion

Som resultaten visar, anti-human CD63 betäckta magnetiska nanopartiklar är i stånd att specifikt fånga små partiklar som har en storlek inom intervallet 70-100 nm. Detta fångade partikeln är i överensstämmelse med den tidigare observerade profilen av exosomer. Vidare är användningen av lågspänning CSW efter tillfångatagandet av partiklarna visade att ta bort dem från pärlytan och orsaka DNA nedbrytningsprofiler som liknar en traditionell lysisbuffert baserad metod för last release. Dessa data tyder på …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrapure Distilled Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3M KcL Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Germany	11426346910
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, Usa	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, USA	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532