Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
Müller-Zellen sind die Haupt gliale Zellen der Retina. Ende ihrer Füße bilden die Grenzen der Netzhaut auf der äußeren und inneren Begrenzungsmembranen (ILM) und in Verbindung mit Astrozyten Perizyten und Endothelzellen sie die Blut-Retina-Schranke (BRB) herzustellen. BRB begrenzt Materialtransport zwischen dem Blutstrom und der Netzhaut, während das ILM wirkt als Basalmembran histologisch die Grenze zwischen der Netzhaut und des Glas Hohlraum definiert. Beschriftung Müller-Zellen ist besonders relevant für den physikalischen Zustand der Netzhautbarrieren zu studieren, da diese Zellen sind ein integraler Bestandteil des BRB und ILM. Sowohl BRB und ILM werden häufig in Netzhauterkrankungen verändert und sind für die Krankheitssymptome verantwortlich.
Es gibt mehrere gut etablierte Verfahren, um die Integrität des BRB studieren, wie die Evans Blau-Assay oder Angiographie. Allerdings sind diese Verfahren nicht auf das Ausmaß der BRB Lässigkeit t informiereno größere Moleküle, im Nanometerbereich. Außerdem liefern sie keine Informationen über den Zustand anderer retinaler Barrieren wie die ILM. Um BRB Permeabilität neben retinalen ILM zu untersuchen, verwendeten wir ein AAV basiertes Verfahren, das Informationen über Permeabilität BRB zu größeren Molekülen während sie den Zustand der ILM und extrazellulären Matrixproteinen in Krankheitszuständen. Zwei AAV-Varianten eignen sich für eine solche Studie: AAV5 und ShH10. AAV5 hat einen natürlichen Tropismus für Photorezeptoren, aber es kann, wenn es in den Glaskörper verabreicht wird, wenn das ILM intakt ist (dh, in Wildtyp-Retina) nicht quer zu der äußeren Netzhaut zu erhalten. ShH10 hat eine starke Tropismus hin Gliazellen und selektive Markierung Müller Glia in gesunden und erkrankten Netzhaut. ShH10 bietet effizientere Genübertragung in Netzhaut, wo ILM gefährdet ist. Diese viralen Tools gepaart mit Immunhistochemie und Blut-DNA-Analyse Aufschluss auf den Zustand der Netzhautbarrieren in Krankheit.
Introduction
Müller-Zellen sind die Haupt glial Komponente der Netzhaut. Morphologisch pannen sie die Netzhaut und ihre radial Endfüßen, in Kontakt mit dem Glaskörper vor der ILM und geheime Komponenten des letzteren. Die ILM ist eine Basalmembran von etwa zehn unterschiedlichen extrazellulären Matrixproteinen (Laminin, Agrin, Perlecan, Nidogen, Kollagen und mehrere Heparinsulfatproteoglykanen) zusammen. Während der Entwicklung ist die Präsenz für die Netzhaut Histogenese, Navigations optischer Axone, und das Überleben von Ganglienzellen 1-3 unverzichtbar. Allerdings ist ILM unwesentlich bei erwachsenen Netzhaut und kann chirurgisch in bestimmten Krankheitsbildern entfernt werden, ohne dass Netzhautschäden 4. Bei der Gentherapie wird diese Membran eine physikalische Barriere für eine effiziente Transduktion der Retina mit AAVs durch intravitreale Injektion 5.
Durch die umfangreiche Verzweigung ihrer Prozesse, Müllerzellen bieten Ernährungs- und regulatorischen support, um sowohl retinale Neuronen und vaskulären Zellen. Müller-Zellen werden auch in die Regulation der retinalen Homöostase beteiligt sind, bei der Bildung und Aufrechterhaltung der BRB 6. Tight Junctions zwischen retinalen Endothelzellen, Müllerzellen, Astrozyten und Perizyten bilden die BRB. BRB verhindert bestimmte Substanzen aus der Eingabe der retina.In vielen Krankheiten wie diabetische Retinopathie, Netzhautvenenverschluss und respiratorischen Erkrankungen, Hypoxie der Retina führt zu Leckagen durch die BRB 7-9. Dieser Bruch wird mit einer Erhöhung der vaskulären Permeabilität, die zu vasogenes Ödem, Netzhautablösung und retinale Schädigung verbunden.
Müller-Zellen sind dicht mit Blutgefäßen und der Basalmembran zugeordnet und spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der BRB und ILM Integrität. Folglich Beschriftung Müller Gliazellen ist besonders relevant für die Untersuchung der physikalischen Zustand dieser Netzhautbarrieren.
KlassikerAlliierten wird BRB Lässigkeit unter Verwendung des Evans-Blau-Assays, die aus der systemischen Injektion von Evans-Blau-Farbstoff, der nicht-kovalent an Plasmaalbumin bindet gemessen. Dieser Test misst die Albuminverlusts (Protein mittlerer Größe, ~ 66 kDa) von Blutgefäßen in der Netzhaut (siehe Protokolle Abschnitt 5) 10. Alternativ kann die Gefäßdurchlässigkeit durch Fluoreszenz retinalen Angiographie Bescheinigung für Leckage von Fluorescein visualisiert werden (kleines Molekül, ~ 359 Da; siehe Protocols Abschnitt 6) 11. Dennoch sind beide Verfahren ermöglichen die Bewertung der BRB Lässigkeit für kleine Moleküle und Proteine, aber sie bieten keine Informationen über das ILM Integrität.
Daher, um BRB Lässigkeit zu untersuchen, verwendeten wir ein AAV basierte Methode, die Informationen über die BRB Permeabilität zu größeren Molekülen (zB AAV-Partikel, 25 nm Durchmesser) einbringt. In der Tat kann unsere Methode Vorhandensein von AAV Transgen im Blut zu erkennen, was vermuten lässt, dass ~ Partikel 25 nm Durchmesser würdein der Lage, in den Blutstrom einzudringen. Dieses Verfahren liefert auch Informationen über die Struktur des ILM und extrazellulären Matrixproteinen in pathologischen Zuständen. Zwei AAV-Varianten eignen sich für eine solche Studie: AAV5 und ShH10. Subretinal injiziert hat AAV5 einen natürlichen Tropismus für Photorezeptoren und retinale Pigmentepithel 12, aber es kann, wenn es in den Glaskörper in Wildtyp-Retina mit intakten ILM 5,13 verabreichten nicht quer zu der äußeren Netzhaut zu erhalten. ShH10 ist ein AAV-Variante, die konstruiert wurde, um gezielt Gliazellen über Neuronen 14,15. ShH10 selektiv Etiketten Müller-Zellen sowohl in gesunden und erkrankten Netzhaut mit erhöhter Effizienz in der Netzhaut mit eingeschränkter Barrieren 16. Diese viralen Tools gepaart mit immuhistochemistry und Blut-DNA-Analysen geben Auskunft über den Zustand der Netzhaut-Barrieren und ihre Beteiligung an Krankheit (Bild 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die BRB regelt den Austausch von Molekülen zwischen Blut und Netzhaut. Dessen Abbau ist mit verschiedenen Krankheiten, wie diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration (AMD) zugeordnet ist. Wir haben kürzlich gezeigt, dass in einer Dystrophin-Knock-out-Maus, die durchlässig BRB zeigt, wird die Netzhaut zügiger der Genübertragung von Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) vermittelt. Trotz BRB Lässigkeit AAV-Partikel injiziert intraokular mit dem Augenraum in diesem Modell beschränkt bleiben. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
